Блоттинг по Саузерну в исследовании ДНК

Обновлено: 18.05.2024

В геноме человека уже открыты гены и установлены последовательности, отвечающие за развитие муковисцидоза, гемофилии, серповидноклеточной анемии, болезни Альцгеймера, семейной гиперхолестеролемии, болезни Гоше и др. Саузерн-блот позволяет диагностировать такие наследственные заболевания путем обнаружения в геноме «дефектных» генов, отвечающих за их развитие. В основе метода лежит технология гибридизации (образование гибридов зонд – мишень). Зондом служит одноцепочечная молекула ДНК, меченная радиоактивным Р 32 и комплементарная искомому гену

Этапы проведения Саузерн-блота:

выделение ДНК из биологического материала;

разрезание ДНК на более мелкие фрагменты с помощью рестриктаз;

разделение фрагментов в агарозном геле;

перенос на нитроцеллюлозу;

блокирование «пустых» зон избытком ДНК;

обработка зондом и образование гибридов;

отмывка несвязавшегося зонда, ауторадиография и расшифровка результатов. Если проявляется полоска, значит, произошло связывание специфического зонда с ДНК пациента.

Такая диагностика наследственной патологии может проводиться и пренатально, в качестве биологического материала в этом случае используют клетки амниотической жидкости.

Принцип гибридизации с радиоактивным зондом лежит и в основе широко используемого метода "отпечатков пальцев ДНК". Каждый организм имеет свою неповторимую последовательность нуклеотидов в ДНК с уникальным расположением сайтов для действия рестриктаз. Поэтому после выделения ДНК и разрезания ее рестриктазами образуются фрагменты разной величины. Эти фрагменты разделяют методом электрофореза в агарозном геле и проводят гибридизацию с пробами радиоактивной ДНК (обычно используют несколько зондов). Каждый зонд специфически присоединяется только в одном или двух местах. Такая разновидность метода получила название «анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов» (RFLP, restriction fragment length polymorphism). Конечная картина состоит из ряда полосок, их расположение уникально и характерно только для одного человека. Одинаковые «отпечатки пальцев ДНК» могут иметь только однояйцевые близнецы.

Применение метода «отпечатков пальцев ДНК»:

Для идентификации личности.

В судебно-медицинской практике — неопровержимое доказательство принадлежности пятен крови, спермы, др. биологического материала.

Комплексная диагностика ряда наследственных заболеваний, в том числе в генетических консультациях для оценки вероятности рождения больного ребенка.

Поиск участков в ДНК, ответственных за развитие патологии (одновременное обследование больного и его родственников позволяет обнаружить изменения в ДНК, ведущие к развитию болезни.

Установление отцовства. В приведенном на рисунке примере — «отпечатки пальцев ДНК» матери (М), ребенка (Р), и двух предполагаемых отцов (О₁ и О₂). Легко установить, что только один из них (О₂) может быть биологическим отцом данного ребенка.

Если ДНК присутствует в биологическом материале в минимальных количествах, используется способ искусственного умножения ДНК — полимеразная цепная реакция (ПЦР). Для проведения ПЦР в пробирке смешиваются компоненты, необходимые для размножения ДНК: исследуемый материал (образец ДНК, который послужит матрицей), субстраты для синтеза (дезоксинуклеозидтрифосфаты), праймеры, ДНК-полимераза (Taq-полимераза). Каждый цикл удвоения ДНК включает в себя несколько этапов (рис 19.2).

Нагревание до 90 ºС (денатурация ДНК).

Охлаждение до 55 ºС (присоединение или «отжиг» праймеров).

Нагревание примерно до 72 ºС (удвоение ДНК).

Затем цикл повторяется. В течение 3 часов можно получить 1 миллион копий ДНК для последующего анализа.

Метод используется в судебной медицине, позволяет выявлять носительство мутантных генов, широко применяется для диагностики инфекционных заболеваний (туберкулез, хламидиоз, цитомегаловирусная инфекция, СПИД и др.). ПЦР позволяет обнаружить возбудителя в биологическом материале даже тогда, когда другие методы оказываются неэффективны.

ДНК-чипы (биочипы, DNA microarray technology)

Данная технология позволяет проводить анализ большого числа генов одновременно. ДНК-чип представляет собой пластинку, на которой зафиксированы небольшие одноцепочечные фрагменты ДНК. Эти фрагменты — комплементарные копии генов, анализ которых представляет интерес для исследователя. Метод основывается на проведении реакции гибридизации флюоресцентно-меченых исследуемых образцов ДНК с чипом. В дальнейшем проводится считывание информации и компьютерный анализ результатов.

Клонирование — способ получения большой популяции идентичных молекул, клеток, организмов — потомков одного предка.

Для клонирования отдельных генов используются технологии рекомбинантных ДНК: нужный ген на специальном носителе вводят в бактериальную клетку. В процессе размножения бактерий получают огромное число копий гена.

Вектор — носитель (плазмида или бактериофаг), в который может быть введена чужеродная ДНК с целью клонирования.

Плазмида — небольшая кольцевидная двухцепочечная ДНК, которая реплицируется независимо от ДНК хозяина.

Принципиальный подход к клонированию генов (рис. 19.3): в плазмиде создают дефект (брешь) с помощью рестриктазы. С помощью этой же рестриктазы вырезают участок ДНК с нужным геном. На рисунке приведены последовательности, распознаваемые рестриктазой EcoR1, и указаны сайты, где этот фермент производит «разрезание» ДНК. Благодаря образующимся «липким концам» происходит включение чужеродной ДНК в вектор, ДНК-лигаза восстанавливает целостность плазмиды, и образованная гибридная молекула помещается в бактериальную клетку.

Рис. 19.3. Генная инженерия. Получение рекомбинантной ДНК

Экспрессия гена, включенного в плазмиду, приводит к образованию бактериями нужного белка, его можно выделить и использовать. Технологии рекомбинантных ДНК позволяют получать для медицинской практики вакцины, лекарственные препараты белковой природы (инсулин, соматотропный гормон, интерфероны, эритропоэтин , тканевый активатор плазминогена и др.).

Метод изучения белков блоттинг: что это, виды

Анаэростат — лабораторное оборудование, прибор, который предназначен для выращивания микроорганизмов в чашках Петри. В частности, он используется для культивирования облигатных анаэробных и микроаэрофильных организмов.

Карбоновые полигоны – это территории, на которых проводятся комплексные исследования по мониторингу уровня содержания парниковых газов в атмосфере, а также исследования по углеродному обмену (атмосфера / почва / вода) параллельно с измерением значимых параметров окружающей среды.

Что такое блоттинг?

Под термином «блоттинг» (Blot) объединены разные виды молекулярного исследования белков и нуклеиновых кислот. Он позволяет разделить, перенести и определить нужные образцы, что значительно упрощает работу по исследованию нужных элементов.

Блоттинг состоит из трёх ключевых этапов:

разделение (separate), когда смеси белков или кислот в полимерном геле обрабатываются электрофорезом;
перенос (transfer), когда отделённые молекулы перемещаются на подготовленные мембраны, обычно выполняемые из нитроцеллюлозы или PVDF;
детекция (detect), когда происходит маркирование образцов иммунохимическими методами, окрашиванием или авторадиографией.

Процесс блоттинга автоматизирован при помощи специального лабораторного оборудования. Это позволяет ускорить изучение образца и избавить сотрудников от необходимости заниматься рутинной процедурой.

Метод используется в генетике, молекулярной биологии, биохимии, научной областях.

Виды блоттинга

Метод блоттинга был разработан британским молекулярным биологом Эдвином Саузерном, поэтому первый подвид методики, Саузерн-блоттинг, назван в его честь. За свою разработку учёный был удостоен премии Ласкера в 2005 году.

Всем последующим названия давались по созвучности, и именно поэтому из всех видов только Саузерн-блоттинг принято писать с большой буквы — только он происходит от имени собственного.

Саузерн-блоттинг даёт возможность выявить в образце определённую последовательность ДНК, он был самым первым, все последующие методики основаны именно на нём;
саузвестерн-блоттинг используется для детекции и визуализации непосредственно связанных с ДНК белков;
назерн-блоттинг помогает в определении последовательности белков в РНК;
вестерн-блоттинг позволяет определить наличие в образце специфических белков;
истерн-блоттинг — это метод обнаружения в образце посттрансляционных модификаций белков.

Блот-анализ проводится с использованием приборов для быстрого блоттинга, а также специфического лабораторного оборудования для проведения каждого из пяти типов исследований. В комплект традиционно входит всё необходимое для работы, в том числе реагенты, а автоматизация позволяет быстро получить результат.

Биология и медицина

Саузерн-блот гибридизация (Southern blot hybridization)

Блоттингом (буквально - промакивание) называют перенос фрагментов макромолекул (ДНК, РНК или белка), разделенных с помощью электрофореза в геле, на твердую подложку - мембрану. В исследованиях генома человека часто используют метод блоттинга, разработанный Саузерном, при котором олигонуклеотидный зонд, находящийся в растворе, гибридизуется с ДНК, адсорбированной на мембране (Саузерн-блот гибридизация, Southern blot hybridization). Геномную ДНК (обычно выделенную из лейкоцитов или клеток плода) расщепляют на короткие фрагменты, разделяют их в агарозном геле, переносят на мембрану, после чего идентифицируют специфические участки с помощью гибридизации с олигонуклеотидными зондами ( рис. 65.6 ). Этим методом выявляют уникальные фрагменты ДНК, размер которых составляет приблизительно одну миллионную часть генома.

Значимость метода для медицины обусловлена возможностью исследовать определенный фрагмент геномной ДНК у любого человека.

Метод используют для выявления крупных перестроек в ДНК и некоторых точечных мутаций (большинство точечных мутаций этим методом выявить нельзя).

Денатурация ДНК осуществляется с щелочью. После окончания электрофореза гель помещают в раствор основания (щелочи), в котором двухчепочечные фрагменты ДНК теряют связи и становятся одноцепочечными.

Перенос ДНК с геля на нитроцеллюлозный или нейлоновый фильтр производится в буферном растворе. Непосредственно на поверхность геля кладут фильтр и стопку фильтровальной бумаги. За счет капиллярного эффекта создается ток буфера, перпендикулярный плоскости геля. Вымываемая из геля ДНК задерживается фильтром и практически полностью оказывается на его поверхности. После переноса одночепочечные нити фиксируют на фильтре. Расположение фрагментов на фильтре точно соответствует их расположению в геле. 3. Для того чтобы визуально выявить нужные фрагменты (фиксированная на фильтре ДНК не видна), проводят гибридизацию со специфическим по нуклеотидной последовательности меченным радионуклидам или флюоресцентной меткой олигонуклеотидным синтетическим зондом (такой зонд состоит из 16-30 пар осваний), или клонированным фрагментом ДНК. Нуклеотидная последовательность зонда должна быть полностью или частично комплементарна изучаемому участку геномной ДНК.

При инкубации фильтра с раствором, содержащим меченый зонд, происходит гибридизация комплементарных цепей ДНК зонда и фрагмента на фильтре. Неспецифические связанные молекулы зонда отмываются с помощью специальной процедуры.

Радиоактивно меченные участки выявляют путем экспонирования фильтра с рентгеновской пленкой (ауторадиография). После проявления на пленке видны полосы меченной зондом ДНК.

Нерадиоактивные метки визуализируют с помощью флюоресценции или опосредованно с помощью антител.

Итак: Саузерн-блот гибридизация - метод анализа структуры заданной области генома, основанный на:

- 1) расщеплении геномной ДНК с помощью эндонуклеаз рестрикции ;

- 2) разделении множества полученных фрагментов с помощью электрофореза в плоской пластине агарозного или другого геля;

- 3) перенесении продуктов разделения на лист пористого материала, например, на нитроцеллюлозный фильтр таким образом, что все фрагменты ДНК переносятся на фильтр и закрепляются на нем, создавая отпечаток, идентичный распределению фрагментов в геле после разделения;

- 4) гибридизации фильтра с меченым радиоактивно или с помощью красителя фрагментом ДНК или РНК (пробой), который по последовательности соответствует анализируемому участку генома. В результате, проба за счет комплементарных взаимодействий связывается с теми участками фильтра, где находятся исследуемые фрагменты генома, и положение этих фрагментов идентифицируется по положению метки из пробы на фильтре.

И как было сказано выше, с помощью Саузерн-блот гибридизации удается определять идентичность или различие длин фрагментов ( полиморфизм длин рестриктных фрагментов, ПДРФ ), получаемых при рестриктном расщеплении одного и того же локуса в разных сравниваемых геномах.

Саузерн-вестерн блоттинг

Саузерн-вестерн блоттинг * Саўзернвестэрн блотынг * Southern-Western blotting — метод быстрой идентификации белка, связанного с ДНК, и определения места его связывания на геномной ДНК. Для этого белки отделяют на SDS-полиакриламидном геле, ренатурируют путем удаления SDS в присутствии мочевины, переносят на нитроцеллюлозу и иммобилизуют в их нативной конфигурации.

Схема метода гибридизации ДНК по Саузерну

Затем проводят рестрикцию (см.) геномной ДНК-мишени, фрагменты метят и осуществляют гибридизацию с иммобилизованными белками в присутствии неспецифической конкурентной ДНК. Связавшаяся с белком ДНК может быть элюирована из каждого индивидуального ДНК-белкового комплекса и проанализирована.

Генетика. Энциклопедический словарь. - Минск: Белорусская наука . Картель Н. А., Макеева Е. Н., Мезенко А. М. . 2011 .

Смотреть что такое "Саузерн-вестерн блоттинг" в других словарях:

Вестерн блоттинг — Вестерн блот анализ белков, разделенных при помощи градиентного электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии SDS.[1] Вестерн блоттинг (белковый иммуноблот, англ. Western blot) аналитический метод, используемый для определения… … Википедия

Вестерн-блоттинг — Метод, аналогичный методу Саузерн блоттинга и применяемый для идентификации электрофоретически разделенных полипептидных цепей (белков); в качестве зондов при В. б. используют меченые антитела. [Арефьев В.А., Лисовенко Л.А. Англо русский толковый … Справочник технического переводчика

Вестерн-блоттинг белковый б — Вестерн блоттинг, белковый б. * вестэрн блотынг, бялковы б. * Western blotting or W. transfer or ligand b. or affinity b. or protein blot техника, применяемая в молекулярной биологии для выявления белков, аналогичная Саузерн блоттингу (см.).… … Генетика. Энциклопедический словарь

Вестерн-блоттинг — Western blotting Вестерн блоттинг. Mетод, аналогичный методу Саузерн блоттинга и применяемый для идентификации электрофоретически разделенных полипептидных цепей (белков); в качестве зондов при В. б. используют меченые… … Молекулярная биология и генетика. Толковый словарь.

Вестерн-Блоттинг (Western Blot Analysis) — метод выявления некоторых белков. После их отделения с помощью электрофореза, белки соединяются с меченными радиоактивным веществом антителами и идентифицируются при рентгенологическом исследовании. Для сравнения: Нозерн блоттинг, Саузерн… … Медицинские термины

ВЕСТЕРН-БЛОТТИНГ — (Western blot analysis) метод выявления некоторых белков. После их отделения с помощью электрофореза, белки соединяются с меченными радиоактивным веществом антителами и идентифицируются при рентгенологическом исследовании. Для сравнения: Нозерн… … Толковый словарь по медицине

Саузерн блоттинг — (от англ. Southern blot) метод, применяемый в молекулярной биологии для выявления определенной последовательности ДНК в образце. Метод Саузерн блоттинга сочетает электрофорез в агарозном геле для фракционирования ДНК с методами… … Википедия

Саузерн-блот — Саузерн блоттинг Саузерн блоттинг (от англ. Southern blot) метод, применяемый в молекулярной биологии для выявления определенной последовательности ДНК в образце. Метод Саузерн блоттинга сочетает электрофорез в агарозном геле для… … Википедия

Вестерн-блот — Вестерн блоттинг (вестерн блот, белковый иммуноблот, англ. Western blot) аналитический метод, используемый для определения специфичных белков в образце. На первом этапе использует электрофорез белков в полиакриламидном геле для… … Википедия

Блоттинг — (от англ. Blot) общее название методов молекулярной биологии по переносу определённых белков или нуклеиновых кислот из раствора, содержащего множество других молекул, на какой либо носитель (мембрану из нитроцеллюлозы, PVDF или… … Википедия

Мембраны для блоттинга

Все файлы в формате PDF. Для просмотра файлов используйте Adobe Reader.

БЛОТТИНГ-МЕМБРАНЫ ИЗ НЕЙТРАЛЬНОГО НЕЙЛОНА (NY)

Блоттинг-мембрана GVS изготовлена из нейтрального гидрофильного нейлона, армированного полиэфирной сетью. Мембрана оптимизирована для связывания белков и воспроизводимого предсказуемого связывания нуклеиновых кислот.

Широко используется в медицинских исследованиях для получения точных ДНК- и РНК-блотов.

Области применения:

Саузерн-блоттинг;
Нозерн-блоттинг;
Связывание белков;
Дот-блоттинг;
Системы детекции с радиоизотопными метками;
Реплика колоний;
Скрининг коллекций.

Особенности материала:

Прочность: усиленная мембрана, что позволяет избежать деформации или загрязнения при многократных переносах;
Высокая связующая способность: связывающая способность по нуклеиновым кислотам составляет 350 мкг/см 2 , при этом мембрана GVS способна связать фрагменты различной длины;
Гидрофильная: нет необходимости использовать смачивающие агенты, которые могут повлиять на качество реплик.

Физические параметры:

Соответствие испытаниям USP Class VI

Толщина

Максимальная температура эксплуатации

Связывание нуклеиновых кислот

Размер пор

от 0,22 до 0,45 мкм

Размеры мембран:

диски: 82 мм; 85 мм; 132 мм; 137 мм (50 шт/упак);

листы: 102×133 мм; 115×160 мм; 150×150 мм; 200×200 мм; 220×220 мм; 225×225 мм; 300×300 мм; 300×500 мм;

рулоны: 150×3000 мм; 200×3000 мм; 300×3000 мм.

БЛОТТИНГ-МЕМБРАНЫ ДЛЯ ЗОНДИРОВАНИЯ ИЗ ЗАРЯЖЕННОГО НЕЙЛОНА (NY)

Блоттинг-мембрана GVS изготовлена из положительно заряженного модифицированного нейлона, специально разработанного для многостадийного переноса. благодаря высокому связыванию белков мембрана применима для саузерн- и вестерн-блоттинга, в том числе щелочного; может применяться для связывания проб с радиоактивными и нерадиоактивными метками.

Системы детекции с радиоактивными/ нерадиоактивными метками;
Нозерн-блоттинг;
Саузерн-блоттинг;
Многоэтапное зондирование;
Щелочной блоттинг;
Перекрёстное сшивание.

Связывание белков (BSA)

диски: 82 мм; 85 мм; 132 мм; 137 мм;

листы: 102×133 мм; 150×150 мм; 200×200 мм; 220×220 мм; 300×300 мм; 300×500 мм;

Блоттинг-мембрана GVS из нитроцеллюлозы предназначена для иммуноблоттинга и работы с белками.

Вестерн-блоттинг;
Иммуноблоттинг;
Связывание белков;
Дот-блоттинг;
Системы детекции с радиоизотопными метками, хемилюминисчентными и хромогенными метками.

0,22 мкм; 0,45 мкм

листы: 70×84 мм; 70×100 мм; 90×120 мм; 100×100 мм; 102×133 мм; 140×160 мм; 150×150 мм; 200×200 мм; 220×220 мм; 250×250 мм; 300×300 мм; 300×500 мм;

БЛОТТИНГ-МЕМБРАНЫ ИЗ УСИЛЕННОЙ НИТРОЦЕЛЛЮЛОЗЫ (MCE)

Блоттинг-мембрана GVS из усиленной нитроцеллюлозы сочетает в себе хорошие связывающие свойства нитроцеллюлозы и прочность нейлона. Может использоваться в любых методиках, для которых рекомендованы мембраны из нитроцеллюлозы.

Вестерн-блоттинг;
Нозерн-блоттинг;
Многоэтапная гибридизация;
Дот-блоттинг.

листы: 70×84 мм; 70×100 мм; 90×120 мм; 100×100 мм; 100×150 мм; 102×133 мм; 140×160 мм; 150×150 мм; 200×200 мм; 220×220 мм; 250×250 мм; 300×300 мм; 300×500 мм;

Блоттинг-мембрана GVS из поливинилиденфторида является естественно гидрофобной, характеризуется высоким показателем связывания белка, что предотвращает прохождение белка сквозь мембрану, низким фоновым сигналом, высокой прочностью на разрыв. Мембрана из ПВДФ обладает высокой устойчивостью к агрессивным веществам, что важно при использовании таких красителей как Amido Black, Colloidal Gold, Coomassie Blue, India Ink и Ponceau-S. Также PVDF мембрана для блоттинга не разрушается под действием метанола, который применяется для смывания красителя.

Вестерн-блоттинг;
Иммуноблоттинг;
Анализ белков и аминокислот.

листы: 70×84 мм; 90×100 мм; 90×120 мм; 100×100 мм; 100×150 мм; 100×200 мм; 150×150 мм; 200×200 мм; 240×240 мм; 260×500 мм;

Читайте также: