Гетерогенность опухолевых клеток. Специфичность раковых клеток.

Обновлено: 09.06.2024

Статья посвящается генетическим аспектам рака щитовидной железы.

Ключевые слова

Для цитирования:

For citation:

В настоящее время уже нет сомнений в том, что в основе злокачественных новообразований лежат повреждения генетического аппарата в герминальной (половой) или соматической клетках, делающие эти клетки чувствительными к воздействию внешнесредовых канцерогенных факторов, способных активизировать процесс малигнизации. В зависимости от того, в какой клетке произошла первоначальная мутация — половой или соматической, рак может быть наследственным и ненаследственным. Гены, ответственные за трансформацию, — это нормальные клеточные гены, участвующие в контроле деления, роста и дифференцировке клеток, но изменение этих генов в конечном счете приводит к неконтролируемому делению клетки. При наследственных формах опухоли начальные изменения (мутации), происходящие в герминальных клетках, будут выявляться во всех клетках, в том числе и в клетках периферической крови. Однако первоначально возникшая мутация в половой или соматической клетке недостаточна для возникновения опухоли. В случае возникновения аналогичной мутации альтернативного гена в гомологичной хромосоме может развиться злокачественная трансформация.

Все это относится и к наследственным формам рака щитовидной железы.

Согласно современным представлениям, рак щитовидной железы — заболевание гетерогенное по гистогенезу, строению опухоли и этиологическим факторам.

А-клеточные новообразования щитовидной железы (папиллярный и фолликулярный рак щитовидной железы)

Первые работы, связанные с выяснением роли наследственных факторов в развитии А-клеточного рака щитовидной железы, были посвящены описанию семей, в которых отмечалось накопление папиллярно-фолликулярного или папиллярного рака щитовидной железы (ПРЩЖ) среди родственников 1-й степени родства [16]. Семейные варианты ПРЩЖ и фолликулярного рака щитовидной железы (ФРЩЖ) составляют 3—7% от всех случаев этих опухолей. В таких семьях выявляется 2—4 пораженных аналогичными опухолями родственника, а в некоторых — и до 8 пораженных родственников [5]. Клиническая картина и прогноз при семейных ПРЩЖ не отличаются от таковых для спорадических форм этого заболевания. Однако в популяционных исследованиях было показано, что в семьях, где уже выявлялось несколько случаев этих форм рака, риск его возникновения у родственников в 8,6 раза больше, чем в контрольной группе [9]. Этот риск увеличивается при заболевании раком щитовидной железы обоих родителей. Кроме того, участие наследственных факторов в развитии этих форм рака подтверждалось наблюдениями заболевания папиллярной аденокарциномой у монози- готных близнецов с последующим развитием у них двустороннего рака молочных желез. Молекулярный дефект, ответственный за развитие этих форм заболеваний, пока неизвестен, но ведется активный поиск генов-кандидатов. Недавно были опубликованы данные о локализации гена на коротком плече хромосомы 19 (19р13.2) [6], ответственного за развитие опухоли щитовидной железы, и гена на длинном плече хромосомы 14 (14q31), ответственного за развитие многоузлового зоба [12]. Кроме того, локализован ген на длинном плече хромосомы 1 (lq21), ассоциированный с семейной формой ПРЩЖ в сочетании с раком почки [14].

К наследственным вариантам относятся и так называемые синдромы "раковых семей", при которых наряду с опухолями молочных желез, кишечника, желудка, эндометрия и другими неоплазиями у нескольких членов одной семьи выявляется ПРЩЖ или ФРЩЖ. Наиболее известной является ассоциация А-клеточного рака щитовидной железы с семейным полипозом толстой кишки и такими его вариантами, как синдромы Гарднера, Туркота. Рак щитовидной железы при синдроме Гарднера (аденоматоз толстой кишки, кожные фибромы и эпидермоидные кисты) встречается с частотой 1 — 3% случаев. Чаще поражаются женщины молодого возраста — 20—30 лет (соотношение женщин и мужчин составляет 10 : 1). В большинстве случаев опухоль в сочетании с этими синдромами мульти- центрична и в 2/3 случаев предшествует обнаружению кишечных полипов. Эти особенности указывают на целесообразность периодического исследования толстой кишки у больных молодого возраста, пораженных раком щитовидной железы, с целью выявления кишечного аденоматоза и, наоборот, у пациентов с семейным полипозом толстой кишки рекомендуется тщательное исследование щитовидной железы. У ряда пациентов с ПРЩЖ, ассоциированным с этими синдромами, обнаруживаются мутации в гене АРС (adenomatous poliposis coli), локализованном в длинном плече хромосомы 5 (5q21), и ряде других генов [17].

Предрасположенность к возникновению синдрома Коудена, при котором имеется повышенный риск развития ПРЩЖ, обусловлена наследственной мутацией в гене PTEN, относящемся, как и ген АРС, к онкосупрессорным генам.

Что же касается спорадического ПРЩЖ, то на сегодняшний день уже известно, что в основе возникновения этого заболевания лежат соматические мутации, затрагивающие ген RET, с последующим образованием химерных онкогенов, кодирующих цитозольные химерные белки [4]. Способность ткани щитовидной железы накапливать йод и родственные ему элементы лежит в основе повышения частоты хромосомных перестроек в клетках щитовидной железы и активации протоонкогена RET на фоне воздействия их радиоактивных изотопов. Этим и объясняется увеличение заболеваемости ПРЩЖ после Чернобыльской катастрофы.

С-клеточные новообразования щитовидной железы (медуллярный рак щитовидной железы)

Наибольшая доля наследственных случаев (20— 30%) наблюдается при медуллярном раке щитовидной железы (МРЩЖ) [1, 2], который является результатом наследования мутаций в RET протоонкогене.

Впервые гистологические особенности МРЩЖ, в частности наличие амилоида в строме, описали J. Hazard и соавт. [10]. Они подчеркнули необходимость выделения этой формы опухоли из-за особенностей ее гистологического строения и клинического течения, занимающего промежуточное положение по прогнозу между высокодифференцированным и анапластическим раком щитовидной железы. Этими же авторами был введен термин "медуллярный рак щитовидной железы". В 1963 г. Р. Manning и соавт. [15] описали сочетание феохромоцитомы, МРЩЖ и гиперпаратиреоза. Вскоре была установлена генетическая природа этого синдрома. Впоследствии были описаны случаи другого наследственного синдрома, включающего в себя МРЩЖ, феохромоцитому, невриному слизистых оболочек, нейрофиброматоз, морфаноподобный фенотип [3]. В 1968 г. A. Steiner и соавт. [22] для обозначения этих опухолевых сочетаний предложили термин "синдром множественных эндокринных неоплазий" 2-го типа — МЭН-2 (МЭН-1, включающий в себя опухолевые поражения паращитовидных желез, гипофиза и гормонопродуцирующей части поджелудочной железы, был описан ранее). Впоследствии МЭН-2 был подразделен на МЭН-2А (синдром Сиппла) и МЭН-2В (синдром Горлина).

МЭН-2 наследуется по аутосомно-доминантному типу. Клинические особенности этого синдрома — выраженный фенотипический полиморфизм, который проявляется тремя типами заболевания: МЭН-2А, МЭН-2В и семейным МРЩЖ.

Для больных с МЭН-2А характерно наличие МРЩЖ, а также феохромоцитомы (50% пациентов) и гиперплазии паращитовидной железы (20— 30% пациентов) [20]. При МЭН-2В наблюдаются те же симптомы, что и при МЭН-2А, но при этом синдроме отсутствует гиперплазия паращитовидной железы. Для больных с МЭН-2В характерны также морфаноподобное телосложение, невриномы слизистых оболочек и нейрофиброматоз [20]. Кроме того, семейный МРЩЖ может встречаться изолированно. МРЩЖ образуется из кальцито- нинпродуцирующих парафолликулярных клеток (или С-клеток) щитовидной железы, которые составляют менее 1% всей клеточной массы этого органа, являются производными неврального гребня и имеют черты, характерные для АПУД-системы. С-клетки секретируют гормон кальцитонин, состоящий из 32 аминокислотных остатков [7] и имеющий несколько иммунореактивных форм. МРЩЖ составляет 4—20% от всех карцином данной локализации. Возраст пациентов варьирует от 13 до 83 лет, средний возраст составляет 44 ± 16 лет для пациентов со спорадической формой, 32 ± И лет для пораженных синдромом МЭН-2Аи 25 ± 7 лет — для синдрома МЭН-2В [20].

Генетической основой заболеваний с синдромами МЭН-2 практически во всех изученных случаях являются наследуемые миссенс-мутации в протоонкогене RET [11]. Ген RET (RE-arranged during Transfection) локализован на длинном плече хромосомы 10 (10qll.2). Он включает в себя 21 экзон. Продуктами гена RET являются тирозинкиназы (ТК) рецепторного типа (полипептиды, состоящие из 1072—1114 аминокислот), которые участвуют в контроле пролиферации, миграции и(или) дифференцировке клеток неврального гребня [23].

В организме человека ген RET экспрессируется в нормальных и опухолевых тканях нейроэндокринного происхождения, включая парафолликулярные С-клетки и МРЩЖ, мозговой слой надпочечников и феохромоцитому, нейробластомы, периферические нервы и их опухоли.

Для большинства мутаций гена RET, выявляемых у пациентов с синдромами МЭН-2, отмечается кластеризация. Они локализованы в одной из двух областей РЕТ-протоонкогена. Единственная точечная мутация в кодоне 918 (экзон 16) обнаружена более чем в 95% семей с МЭН-2В [И]. Эта мутация (ATG->ACG) приводит к замене метионина на треонин в цитоплазматическом тирозинкиназном домене RET-белка. Миссенс-мутации в 1 из 5 цистеиновых кодонов — 609, 611, 618, 620 (экзон 10) или 634 (экзон 11) — в экстраклеточном домене ТК идентифицированы более чем в 95% семей с МЭН- 2А и в 70—80% с семейным МРЩЖ [13].

У больных со спорадическими формами МРЩЖ также идентифицированы соматические мутации в гене RET, которые частично совпадают с мутациями при МЭН-2.

В настоящее время установлено, что ряд мутаций в протоонкогене RET, затрагивающих 1 из 5 цистеинов в цистеинобогащенной области экстра- клеточного домена ТК, приводят к конститутивной активации ТК в результате образования ковалентно связанных гомодимеров RET-белка [19|.

МЭН-2В-мутация в кодоне 918 (тирозинкиназный домен) также приводит к конститутивной активации ТК, но без димеризации последней. Кроме того, эта мутация изменяет субстратную специфичность фермента [19], что приводит к автофосфорилированию тирозиновых остатков ТК по новым сайтам, а также к фосфорилированию некоторых новых клеточных белков.

При мутациях RET-онкогенов могут происходить трансформации фибробластов [19].

Итак, мутации, ассоциированные с МЭН-2- синдромами, превращают нормальный протоонкоген RET в доминантный трансформирующий онкоген, продукты которого обладают конститутивной тирозинкиназной активностью и повышенной способностью к фосфорилированию. В случае с мутацией, выявляемой при МЭН-2В, ТК проявляют измененную субстратную специфичность. Механизм злокачественной RET-трансформации С-клеток in vivo в настоящее время неизвестен.

Накопленный к настоящему времени материал по МЭН-2 позволяет установить связь между теми или иными мутациями, обнаруживаемыми у больных, и их фенотипом. Так, при обследовании самой большой выборки семей с МЭН-2, собранной Международным консорциумом по RET-мутациям (477 семей), была установлена тесная связь между присутствием одной из мутаций в кодоне 634 и наличием феохромоцитомы и гиперплазии паращитовидных желез [8]. В обследованной российской семье с МЭН-2А (мутация Cys 634 Arg) мы также обнаружили такую взаимосвязь: наличие феохромоцитомы было установлено для членов родословной 1/2, 2/2 и 2/3 (рис. 1).

Итоги анализа работ, посвященных генетике рака щитовидной железы, можно суммировать следующим образом. Результаты исследований в этой области свидетельствуют о несомненном наличии генетически обусловленных форм рака щитовидной железы, удельный вес которых в структуре онкопатологии этого органа зависит прежде всего от гистогенеза опухоли. Так, работы, посвященные А-клеточному раку, носят преимущественно описательный характер, представляя отдельные наблюдения семейных случаев этой патологии, а также попытки поиска биохимических и молекулярных маркеров. В то же время при С-клеточном раке щитовидной железы отмечаются генетическая гетерогенность и клинический полиморфизм. На основе этих данных разработаны принципы медикогенетического консультирования, направленного на уточнение прогноза у потомства пораженных лиц, раннюю диагностику и профилактику заболевания.

В качестве способа идентификации наследственных форм рака щитовидной железы и формирования групп риска, подлежащих углубленному клиническому обследованию с целью выявления у них С-клеточной патологии щитовидной железы, нами предложена программа (рис. 2), основанная на генетической гетерогенности рака щитовидной железы, возникновение которого, исходя из двухмутационной теории Кнудсона, определяется 1 из 3 возможных вариантов: 1) наследованием мутации в половых клетках, следствием чего является генетически детерминированная предрасположенность к медуллярному раку, проявляющаяся в виде С-клеточной гиперплазии с гиперкальцитонинемией (иногда скрытой), которая реализуется в рак в результате второй (соматической) мутации в клетках тканей щитовидной железы; 2) мутацией "de novo" в герминальных клетках одного из родителей. В этом случае фенотипические проявления аналогичны предыдущему варианту при отсутствии заболевания или предрасположенности к нему у родителей; 3) двумя соматическими мутациями "de novo", т. е. мутациями в С-клетках щитовидной железы, которые по наследству не передаются.

Наиболее важным с точки зрения формирования групп генетического риска является первый вариант, который можно выявить у пациента при определении уровня кальцитонина в сыворотке крови и выявлении мутации в гене RET. Чувствительность определения уровня кальцитонина (особенно после стимуляции пентагастрином) настолько велика, что некоторые исследователи рекомендуют производить операцию на щитовидной железе даже без явных клинических признаков заболевания, только на основании повышения базального или стимулированного уровня гормона в сыворотке крови при положительном семейном анамнезе. При анализе 14 работ, посвященных этому пока спорному вопросу, получены следующие данные: тиреоидэктомия была произведена у 80 лиц из семей МРЩЖ. Показания к операции определялись наличием гиперкальцитонинемии (в ряде случаев после стимуляции). После- и дооперационное гистологическое исследование позволило в 61 случае обнаружить микроочаги МРЩЖ, не выявляемые клиническими или иными методами обследования; у 18 пациентов диагностирована С-клеточ- ная гиперплазия и только в 1 случае патологических изменений не найдено [1, 2].

В настоящее время при наличии повышенного уровня кальцитонина и обнаружении мутации гена RET рекомендуется проводить целенаправленное обследование всех родственников 1-й степени родства для выявления лиц — носителей патологического гена (анализ проводится с согласия обследуемого). В подобной ситуации рак необходимо рассматривать как менделирующий признак, наследуемый по аутосомно-доминантному типу, и риск для потомства больных составляет приблизительно 50% с учетом высокой пенетрантности. Для сибсов пациентов и сибсов родителей сохраняется такая же вероятность заболеть, поэтому их необходимо включать в группу повышенного риска с постоянным диспансерным наблюдением и обязательным определением уровня кальцитонина после стимуляции пентагастрином и выявлением мутаций гена RET.

При выявлении мутации в гене RET в дальнейшем рекомендуется ежегодное проведение теста с пентагастрином начиная с 5—6-летнего возраста. При высоком содержании кальцитонина рекомендуют тотальную тиреоидэктомию в возрасте 10— 13 лет. Примерно у 50% детей в этом возрасте обнаруживаются микроскопические очаги МРЩЖ. Использование такого подхода позволяет говорить о 90% излечении детей [21]. Такое неполное излечение многими авторами объясняется, с одной стороны, наличием невыявленных метастазов в шейных лимфатических узлах, с другой — неполным удалением щитовидной железы и части С-клеток, которые и являются источником рецидива МРЩЖ.

Другой подход к лечению и наблюдению пациентов с наследственным МРЩЖ и синдромами МЭН-2А и МЭН-2В заключается в проведении тиреоидэктомии только на основании обнаружения наследуемой мутации гена RET, так как более чем у 90% детей с такой мутацией рано или поздно развивается МРЩЖ. В этом случае рекомендуется радикальная тиреоидэктомия в возрасте до 6 лет с последующей заместительной терапией левотироксином. Такое профилактическое оперативное лечение вполне обоснованно, так как вероятность трансформации С-клеток и метастазирования в таком возрасте исключена. Поданным В. Pasini и соавт. [18], генетический скрининг обычно положительно воспринимается членами семьи, а раннее и радикальное оперативное лечение ребенка, как правило, поддерживается родителями.

Иллюстрацией сказанного может служить родословная семьи, наблюдаемой нами в Российском онкологическом научном центре (см. рис. 1). У пациента (3/2) клинически установленный диагноз МЭН-2А подтвержден молекулярными исследованиями: в ходе анализа экзона 11 гена RET нами обнаружена известная и наиболее частая при МЭН- 2А мутация TGC-»CGC в кодоне 634 в гетерозиготном состоянии. Выявленная мутация приводит к замещению цистеинового аминокислотного остатка в цистеинобогащенном экстраклеточном тирозинкиназном домене RET на аргинин. Аналогичная мутация была идентифицирована у матери (2/3) и двоюродной сестры пациента (3/1). Пациенту (как и его 9-летней двоюродной сестре) произведена профилактическая тиреоидэктомия. При гистологическом исследовании операционного материала пробанда обнаружено 4 фокуса МРЩЖ.

Факторы риска развития рака молочной

В статье приведен анализ данных литературы относительно роли основных факторов риска в механизмах развития рака молочной железы(РМЖ) (наследственного фактора, фоновых предраковых заболеваний, роли иммунодефицита, гормонального дисбаланса при различных эндокринопатиях, возрастного фактора и ряда других) на молекулярно-клеточном, органном и системном уровнях. Авторы делают акцент на механизмах онкогенной трансформации клеток под влиянием гиперэстрогении различного генеза, на фоне гипотиреоза, а также избыточного образования свободных радикалах при различных формах патологии, обладающих мутагенной активностью и нарушающих процессы межклеточного взаимодействия. Важная роль в переходе первой стадии канцерогенеза - онкогенной трансформации в стадию промоции отводится предшествующим и сопутствующим иммунодефицитным состояниям, когда нарушается элиминация малигнизированных клеток.

Неопластический процесс представляет собой необратимый, персистентный, аутохтомный рост клеток, обусловленный расстройством взаимодействия протоонкогенов и антионкогенов на основе ступенчатых изменений генома моноклона клеток [6, 10, 12, 16].

В настоящее время, очевидно, что факторы риска, этиологические факторы и пусковые механизмы развития неоплазии, в частности рака молочной железы, чрезвычайно гетерогенны [8, 9, 12, 13, 19, 20,22, 23, 31, 33].

Основные факторы риска развития рака молочной железы представляются следующим образом:

наследственная предрасположенность;
сдвиги гормонального баланса в частности нарушения продукции и рецепции гонадотропных гормонов гипофиза, а также эстрогенов, прогестерона, гормонов щитовидной железы, пролактина - основных регуляторов пролиферации и дифференцировки эпителия протоков и альвеол молочной железы и их функций;
возрастной фактор (в 85% рак развивается после 40 лет);
развитие иммунодефицита и нарушение элиминации опухолевых клеток;
наличие феминизирующих опухолей яичников, сопровождающихся гиперэстрогенией;
применение эстрогензаместительной терапии с целью устранения симптомов климактерического и посткастрационного синдромов;
наличие гиперпластических процессов в молочной железе: фиброаденоматоза и фиброаденомы, внутрипротоковой папилломы;
к факторам риска развития рака молочной железы относятся такие формы экстрагенитальной патологии как ожирение, сахарный диабет, гипертония, а также хроническое действие стрессорных раздражителей;
риск развития рака молочной железы возрастает при наличии в анамнезе и предшествующем лечении рака яичников, эндометрия, толстой кишки;
реальное модифицирующее действие на организм и частоту возникновения в популяции гормонозависимых новообразований оказывает характер питания, избыток в пище жиров и полиненасыщенных жирных кислот;
к факторам риска молочной железы относят и первые роды после 34 лет, аборт после 35 лет, менопаузу после 50 лет и другие.

Касаясь роли наследственного фактора, в развитии рака молочной железы, необходимо отметить его роль примерно в 5-10% заболеваний. Наследственная форма рака чаще диагностируется у молодых женщин репродуктивного возраста [18]. Как показывают клинические наблюдения, наличие в семье родственников, больных раком молочной железы, значительно повышает риск развития заболевания. В связи с этим была выделена особая нозологическая форма патологии - рак молочной железы, в рамках которой возможно наличие различных генетически детерминированных форм. Причем, авторы не исключают возможность наличия в популяции двух форм рака молочной железы - наследственного и спорадического.

На основе изучения отдельных родословных были предложены следующие критерии для выделения «наследственного» рака молочной железы:

более ранний возраст начала заболевания;
двусторонность поражении;
«вертикальная» передача заболевания;
наличие специфических опухолевых ассоциаций;
улучшенная выживаемость больных.

Так, Я.В. Бохман, 1993г., на большом клиническом материале изучил роль генетической предрасположенности в развитии рака различной локализации. Оказалось, что у кровных родственниц больных раком молочной железы риск развития этого заболевания в 3-5 раз выше, чем в женской популяции в целом. Исследование семейного фона выявило ассоциацию рака яичников с карциномой эндометрия и молочной железы. Кроме того, у родственниц больных раком эндометрия отмечается высокая частота рака молочной железы, рака яичников и рака толстой кишки. В настоящее время утвердилось мнение о том, что более ранний возраст манифестации рака является ведущим признаком всех наследственных неоплазий, в том числе и рака молочной железы. Это обусловлено развитием мутации уже в зародышевых клетках, для манифестации которой необходима повторная соматическая мутации. При наследственной форме рака все ткани несут «патологический» ген, поэтому наследственный рак характеризуется первично множественным поражением. Были выявлены такие опухолевые ассоциации, как рак молочной железы и гастроинтестинальный рак; рак молочной железы и рак яичников; рак молочной железы и опухолей мягких тканей, мозга, языка и гортани, адренокортикальная аденома (SBLA -синдром). Различные опухолевые ассоциации свидетельствуют о генетической гетерогенности рака молочной железы. Одним из значительных достижений в молекулярно-генетических исследованиях РМЖ явилось открытие генов BRCA1 и BRCA2, терминальные мутации которых определяют наследственную форму этих новообразований. Наследственные мутации этих генов обуславливают от 56% до 80% риска развития РМЖ на протяжении всей жизни [22, 26]. Спектр мутаций гена BRCA1 достаточно широк: 71% мутаций относится к сдвигу рамки считывания за счет микро - мини - делеций. Как известно, ген BRCA1 локализован на участке 17q21.1.-21.2. Потеря экспрессии BRCA1 коррелирует с усилением пролиферации и увеличением опухолевого узла.

Другим геном-супрессором, более специфичным для РМЖ, является ген BRCA2. Мутация этого гена играет важную роль в развитии семейных случаев РМЖ как у мужчин, так у женщин [18]. Наряду с наследственным фактором, важная роль в развитии рака молочной железы отводится гиперпродукции эстрогенов, образованию их реактивных метаболитов, а также изменениям рецепции этих гормонов клетками мишенями. Высказывается точка зрения, что под влиянием эстрогенов возникает экспрессия некоторых протоонкогенов в клетках-мишенях, в частности гена c-fos, гена c-myc, гена c-jun, стимулируется образование циклинов, циклинзависимых киназ, аутокринных и паракринных ростовых факторов и их рецепров [9, 21, 39]. Установлено, что процесс промоции при раке молочной железы, а также неоплазий другой локализации связан с мощной индукцией эстрогенной рецепторной системы. Эстроген-индуцированные белки-факторы роста оказывают аутокринные или паракринные эффекты. Установлено, что рецепторы полипептидных факторов роста относятся к семейству ERBB, экспрессированы на мембранах клеток, причем наибольшее значение имеют ERBB2 или HER2/neu. В процессе интенсивной гормональной стимуляции эстрогеновых рецепторов молочной железы возникает усиление образования трансформирующего фактора роста альфа (TGF-a), относящегося к семейству EGF (эпидермального фактора роста). TGF- a - стимулирует митотическую активность, рост опухолевых и нормальных клеток эпителиального происхождения, обладает ангиогенной активностью [9, 32, 35, 38]. В то же время образование эстроген-рецепторного комплекса индуцирует синтез инсулиноподобного фактора роста и подавляет образование трансформирующего фактора роста бета (TGF- |3). Последний принадлежит семейству EGF, тормозит деление опухолевых и нормальных клеток, повышает их дифференцировку [9, 36, 37, 40].

Клетки стромы молочной железы благодаря выделению фибробластического фактора роста стимулируют собственную пролиферацию, а паракринно-эпителиальные опухолевые клетки. Фактор роста тромбоцитарного происхождения усиливает пролиферацию мезенхимальной стромы раковых опухолей [9, 11, 34]. Существенно отметить, что значительная часть клеток, подвергшихся онкогенной трансформации, погибает на ранних стадиях промоции в процессе апоптоза. Характерной особенностью воздействия эстрогенов на клетки мишени является угнетение апоптоза при участии онкогена bcL-2 [14]. Согласно данными ряда авторов, эстрогены способствуют накоплению микросателлитных структур ДНК клеток-мишеней, рассматриваемых как проявление дефектной репарации ее повреждений. Показано, что онкогенной активностью обладают не только половые гормоны, но и продукты их взаимопревращений, в частности продукты 2-гидроксилирования, 16-альфа-гидроксилирования и 4-гидроксилирования, так называемые катехолэстрогены. В механизмах онкогенной трансформации эпителия молочных желез, особенно важная роль отводится усилению процесса 16 альфа-гидроксилирования эстрона [7, 14].

В ряде работ показано, что активность ферментов метаболизма эстрогенов - катехол-О-метилтрансферазы и глутатион-S-трансферазы резко снижается в метастазах гормонозависимых опухолях молочной железы. Последнее приводит к накоплению высокоактивных производных эстрогенов, обладающих мутагенным эффектом и способствующих появлению более злокачественного фенотипа опухолевых клеток [15]. Важная роль в механизмах индукции рака молочной железы отводится увеличению содержания свободного эстрадиола в крови, наиболее выраженному у женщин в менопаузе. Источником канцерогенной промоции эпителиальных клеток молочных желез могут служить оральные контрацептивны и гормональные препараты, используемые при менопаузе в качестве заместительной терапии.

Установлено, что в постменопаузальном периоде наблюдается падение уровня эстрогенов в крови, а затем медленный рост за счет внеяичникового превращения андростендиона в эстрон с по мощью ароматазы. Процесс периферической трансформации надпочечниковых андрогенов происходит в жировой ткани, печени, мышцах и ткани опухоли молочной железы [25]. При этом изменяется соотношение отдельных фракций эстрогенов с преобладанием эстрона над эстрадиолом. Знание этого факта привело к представлению о том, что одним из эффективных способов лечения РМЖ в постменопаузальном периоде является использование ингибиторов ароматазы [18, 23, 25].

Одним из ведущих факторов риска развития РМЖ является гипотиреоз наследственного или приобретенного характера. Как оказалось, от уровня гормонов щитовидной железы зависит превращение эстрадиоловых фракций эстрогенов в эстриол. Причем, в условиях гипотиреоза, интенсифицируется указанная конверсия гормонов [6, 9]. Показано также, что при снижении оптимального уровня гормонов щитовидной железы возникает стимуляция роста эпителиальных клеток молочных желез, развитие дисплазии и неоплазии.

Ряд исследователей высказывают точку зрения о том, что одним из ключевых факторов риска развития рака молочной железы является усиление продукции инсулинподобного фактора роста I (ИПФР). Рецептор ИПФР считается крайне важным для обеспечения клеточного деления, и его усиленная экспрессия приводит к неопластической трансформации клеток [9]. Высказывается точка зрения, что наряду с ИПФР, инсулин играет важную роль в регуляции митогенной активности клеток, облегчает развитие стадии промоции опухолевого роста. В связи с этим имеются указания на роль гиперинсулинемии как фактора риска в развитии ряда опухолей.

Как известно, важная роль в механизмах митогенного действия, а также инвазивности и метастазировании раковых клеток отводится лизосомальному ферменту катепсину Д (урокиназный активатор плазминогена). Увеличение продукции катепсина Д опухолевыми клетками является прогностически неблагоприятным признаком [16]. Установлено, что для формирования клинически значимой опухоли необходимо образование критического пула опухолевых клеток, когда процесс становится необратимым. Развитие опухоли является интерактивным процессом, исход которого определяется, с одной стороны, большим или меньшим потенциалом факторов агрессии опухоли, а с другой - состоянием специфических иммунологических механизмов защиты и неспецифических факторов резистентности, обеспечивающих элиминацию опухолевых клеток. В связи с этим очевидно, что одними из ведущими факторами риска развития онкологических заболеваний, в том числе и рака молочной железы, являются иммунодефицитные состояния, характеризующиеся недостаточностью специфических и иммунологических механизмов защиты и неспецифических факторов резистентности, первая линия защиты биологической системы от опухолевых клеток обеспечивается макрофагами и натуральными киллерами (NK-клетками), часть опухолевых клеток разрушается за счет свободных радикалов и перекиси водорода продуцируемой макрофагами. Часть естественных киллеров активируемых под влиянием ИЛ-2 и TNF-альфа превращаются в клетки повышенного цитотоксического потенциала - лимфокин-активированные киллеры, в связи с чем предпринимаются попытки использовать такие клетки в терапии злокачественных новообразований. Очевидно, что снижение количества и активности NK-клеток в крови наследственного и приобретенного А-зависимого иммунодефицита могут быть факторами риска перехода стадии онкогенной трансформации клеток в стадию промоции и соответственно развития неоплазии, в частности рака молочной железы. Установлено, что неспецифические механизмы противоопухолевой защиты эффективны, когда количество опухолевых клеток не превышает 1000 [12, 23]. Что касается специфического противоопухолевого иммунитета, то он зачастую развивается слишком поздно и оказывается не эффективным. В то же время, в процессе опухолевой прогрессии возникает выраженный вторичный иммунодефицит, обусловленный системным действием опухоли на организм и усугубляющийся по мере использования полихимио- и лучевой терапии.

Наряду с вышеописанными факторами риска развития рака молочной железы, включающими наследственный фактор, возрастной фактор, нарушения гормонального и иммунного статуса, предшествующие онкологические заболевания, необходимо отметить ряд заболеваний молочной железы, относимых к фоновой предраковой патологии [2]. К последним с определенной вероятностью относятся: фиброаденома, киста молочной железы, внутрипротоковая папиллома, диффузная форма фиброзно-кистозной мастопатии и другие формы патологии [24]. Следует отметить, что важная роль в механизмах онкогенной трансформации клеток, нарушениях межклеточного взаимодействия и метастазирования малигнизированных клеток при различных формах патологии, в том числе и при фоновых предраковых заболеваниях, отводится активации процессов липопероксидации, свободнорадикальной дезорганизации субклеточных фракций клеток различных органов и тканей [1, 3, 17, 27, 30].

Как известно, интенсификация свободно-радикального окисления является неспецифическим процессом, эфферентным звеном реализации цитопатогенного действия многих факторов инфекционной и неинфекционной природы в том числе и онкогенных. В связи с этим действие чрезвычайных стрессорных раздражителей, индуцирующих развитие оксидативного стресса, является одним из факторов риска развития неоплазии [28, 29].

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:

RISK FACTORS OF BREAST CANCER DEVELOPMENT

Chesnokova N.P., Barsukov V.Yu., Plokhov V.N.

Saratov state medical university

Data analysis of the role of the main risk factors in the development of breast cancer is presented. Such risk factors as heredity, background precancer diseases, immunodeficiency, hormonal misbalance in different endocrine pathologies, ageing, etc. are taken into account. These factors are considered at different levels: molecular, cellular, organ and systemic. Mechanisms of oncogenic cellular transformation in hyperestrogenia of various genesis accompanied by hypothyroidism are emphasized. Excessive formation of free radicals in various pathologies having mutagenic activity and a negative impact on intercellular processes is paid attention to. Underlying and accompanying immunodeficiency conditions when elimination of malignant cells is impaired are found to play an important role in transition of the first phase of cancerogenesis, i.e. ocogenic transformation, into the phase of promotion.

Опухолевые разговоры, или Роль микроокружения в развитии рака

Обзор

Автор

Редактор

Клетки многоклеточного организма существуют не сами по себе, а в создаваемом ими самими тканевом окружении, подобно людям, являющимся элементами общества. Клеточная микросреда не только играет важнейшую роль в поддержании функционирования клетки, но и сама активно на него влияет. Реципрокные динамические взаимодействия между клеткой и ее окружением играют решающую роль в развитии онкологических заболеваний, ставших бичом нашего времени. Развитие современных технологий лабораторного изучения клеток и их микроокружения позволяет отследить эти процессы в беспрецедентных деталях и даже смоделировать в лаборатории микросреду по своему желанию.

Написание и размещение этой статьи оплачено ООО «Компания Хеликон», специализирующейся на комплексном оснащении биологических лабораторий и поставке решений на основе микрофлюидики. «Хеликон» никак не влиял на содержание этой статьи.

Жизнь на Земле начиналась с простейших организмов, состоящих из одной клетки, которой приходилось быть самостоятельной и самодостаточной. Однако со временем начали появляться и более сложные существа. Клетки в них уже различались внешне и отвечали за разные функции организма, хотя всё еще могли быть не разнесены в пространстве. Что же касается современных многоклеточных организмов — тут уже не скроешь высокую сложность их устройства и сотни типов клеток, образующих ткани, складывающие всё тело: от носа до кончика хвоста. И здесь клетки должны работать особенно слаженно.

Для этой цели в ходе эволюции выработалась система «общения» между клетками, похожая на нашу речь, только вместо слов в ней используются молекулы. Так, клетки могут «общаться» и с дальними соседями (как это происходит в гормональной системе), и со своим ближайшим окружением — микросредой. Среди важных примеров такого взаимодействия — появление дифференцированных клеток из клетки-предшественницы — например, стволовой клетки (СК). Стоит только вспомнить схему гемопоэза (рис. 1): из одной мультипотентной (способной дать начало целой родословной) клетки в результате многостадийного процесса под влиянием различных сигналов появляются и разнообразнейшие варианты иммунных клеток, и форменные элементы крови.

Рисунок 1. Постэмбриональный гемопоэз у человека: гемопоэтическая СК костного мозга дает начало миелопоэзу и лимфопоэзу. Рисунок из «Википедии». Чтобы посмотреть рисунок в полном размере, нажмите на него — он откроется в новой вкладке.

Специализированную физиологическую микросреду, в которой находится СК, называют тканевой нишей. Она поддерживает основные характеристики, отличающие стволовую клетку от всех остальных: плюрипотентность и способность самообновляться [1]. Начнет ли клетка делиться либо останется в покоящемся состоянии, тоже во многом зависит от среды вокруг нее [2, 3].

* — Если природа иногда очень неуместно наделяет клетки «стволовыми» свойствами, то человек старается сделать это целенаправленно — не просто индуцировать плюрипотентность у подходящих типов клеток, но учесть все возможные последствия такого перепрограммирования: «Была клетка простая, стала стволовая» [5], «Снежный ком проблем с плюрипотентностью» [6], «В поисках клеток для ИПСК — шаг за шагом к медицине будущего» [7]. — Ред.

Рисунок 2. Гетерогенная структура опухоли. На начальном этапе онкогенеза хроническое воспаление, накопление активных форм кислорода (АФК) и старение способствуют клональной экспансии клеток с генетическими или эпигенетическими нарушениями. Впоследствии в этих клетках могут произойти дополнительные мутации, и тогда они могут дать начало злокачественной опухоли. Сама опухоль вскоре оказывается гетерогенной, состоящей из нескольких субпопуляций раковых клеток, — благодаря «побочным» мутациям или эпигенетическим изменениям. Рисунок из [9], адаптирован.

Более того, раковые клетки (РК), выделяя сигнальные молекулы, подготавливают специальные ниши для будущих метастазов. В этой связи крайне перспективной становится возможность манипулировать раковыми стволовыми клетками, влияя не на них самих, а на их микросреду или на окружение метастазов. Некоторые исследователи утверждают, что будущее противоопухолевой терапии — это разработка препаратов, направленных на РСК и метастатические ниши.

Структура микроокружения

Микроокружение первичной опухоли (появившейся недавно «с нуля» и еще только готовящейся дать метастазы) очень разнородно. В него входят другие клетки, кровеносные сосуды, внеклеточный матрикс (ВКМ) и целый коктейль из сигнальных молекул. Эти факторы не только поступают извне, но и секретируются самими РК. Иными словами, это двунаправленный процесс: и рак влияет на свою среду, и среда влияет на рак (рис. 3) [17]. Один из классических примеров — это то, как опухоли увеличивают для себя приток питательных веществ. Они выделяют молекулы (например, фактор роста эндотелия сосудов, VEGF), воздействующие на соседние эндотелиальные клетки и провоцирующие рост сосудов — ангиогенез [18].

Рисунок 3. Регуляция ниши стволовых клеток нормального кишечного эпителия и колоректального рака. Слева — Сигнальные молекулы, секретируемые кишечными субэпителиальными миофибробластами (ISEMFs) и клетками Панета (Paneth), способствуют обновлению пула СК и нормальной кишечной пролиферации. Справа — Состав микроокружения способствует размножению клеток колоректального рака (КРР) либо их переходу в состояние покоя, из которого они — под влиянием того же микроокружения — могут выйти и восстановить свой онкогенный потенциал. Рисунок из [17], адаптирован.

Роль воспалительных реакций

Микроокружение опухоли характеризуется постоянным воспалением. М2-макрофаги, нейтрофилы, тучные клетки, повышенная концентрация медиатора воспаления оксида азота (NO), многие провоспалительные цитокины — всё это способствует процветанию РК и увеличению агрессивности рака [19]. Поддерживают развитие опухоли также регуляторные Т-клетки и Т-хелперы 2 типа.

Среди сложнейшей сети сигнальных путей особое место по отношению к раку отводится двум системам, приводящим к активации генов, — NF?B и STAT3. Эти факторы транскрипции могут начать работу в ответ на многое: воспаление, бактериальные или вирусные антигены, стресс, свободные радикалы. Используя эти пути, опухоль образуется, пролиферирует, активирует процессы ангиогенеза и инвазии, метастазирует — в общем, делает практически всё для собственного развития. Как оказалось, активация NF?B задействована даже в формировании резистентности рака к химиотерапии и облучению. Эти виды лечения эффективно убивают дочерние раковые клетки, но редко уничтожают сами РСК [19], что обычно имеет печальные последствия в форме обострения болезни спустя какое-то время.

Однако иммунное микроокружение опухоли может оказывать и обратное влияние. Тогда в него включены другие клетки: M1-макрофаги, Т-хелперы 1 типа, цитотоксические Т-клетки, АПК и естественные киллеры [20]. Переключение с антиопухолевого режима на проопухолевый сейчас активно изучается. К примеру, недавно показано, как рак подавляет нормальные функции эффекторных Т-клеток [21].

Внеклеточный матрикс

Внеклеточный матрикс — это каркас микроокружения, формирующий его механическую структуру*. Его создают мезенхимальные клетки: фибробласты, хондроциты, остеобласты. Состав внеклеточного матрикса очень сложен и многообразен: в него входят коллагены — основные белки соединительной ткани (например, коллаген типа IV), протеогликаны, гликопротеины (фибронектин и ламинин-1) и другие компоненты. Ключевые ферменты матрикса — матриксные металлопротеиназы (ММП), разрушающие практически любой белок внеклеточного пространства и тем самым преобразующие его структуру. Двунаправленное влияние ВКМ и РК при некоторых условиях может способствовать прогрессированию опухоли, влиять на ее агрессивность и способность расселяться по всему организму [20]. Например, не только опухолевая клетка для своего роста ремоделирует матрикс, выделяя ММП, но их могут выделять и стромальные клетки микроокружения, облегчая инвазию РК.

* — Внеклеточный матрикс — это вообще святая святых многоклеточной организации. Это «духовные скрепы» и платформа для реализации «организменного законодательства», призванного ограничить права (свободу) индивидуальных клеток и навязать обязанности — всё сугубо для процветания целого организма. Почему это выгодно отдельным клеткам, как неразумные бунтуют, формируя опухоли, и как вообще складывалась в эволюции вся эта система клеточной кооперации, рассказано в статье «Дипломатия клеток: взлёты и падения» [22]. — Ред.

Метастазирование и метастатические ниши

Метастазирование — это процесс распространения и расселения клеток первичной опухоли по организму и образования новых опухолей. Оказывается, вторичная опухоль образуется не в случайном месте, а в зоне с подходящим микроокружением, которую дистанционно «подготовила» первичная опухоль посредством сигнальных молекул. До попадания РК такая ниша считается преметастатической, а после — метастатической (рис. 4). Сложные взаимодействия между попавшей в нишу клеткой и микросредой обеспечивают успешное разрастание метастаза из одной клетки, принимающейся активно делиться.

Рисунок 4. Метастатические ниши в период ранней колонизации отдаленных органов. а — Системные изменения, вызванные первичной опухолью молочной железы: мобилизация рецептора 1 фактора роста эндотелия сосудов (VEGFR1) и клеток костного мозга (BMDCs), привлечение РК в легкие, ремоделирование внеклеточного матрикса (ВКМ) и формирование преметастатической ниши, которая способствует колонизации легких клетками рака молочной железы. б — Клетки рака простаты попадают в нишу остеобластов, конкурируя с гемопоэтическими стволовыми клетками (HSCs). Хемокин CXCL12 способствует колонизации путем взаимодействия с рецептором CXCR4. в — Клетки рака молочной железы приносят с собой свой «нишевый материал», тенасцин C (TNC), ускоряя этим колонизацию легких. г — Активированные миофибробласты секретируют компоненты метастатической ниши TNC и периостин (POSTN), усиливая рост метастаза. Рисунок из [2], адаптирован.

Метастатические ниши (МН) рассеяны по всему организму и даже могут перемещаться с развитием болезни. Их можно найти и в гипоксичных областях, и во фронтах инвазии, и даже в обычных нишах СК [2]. Влияние РК на микроокружение позволяет перенастроить изначально неподходящие окружающие условия себе на пользу. Состав МН схож с микроокружением первичной опухоли: он представлен сосудистой сетью, компонентами внеклеточного матрикса и стромы — мезенхимальными и иммунными клетками. Микросреда отличается крайне активной «жизненной позицией». Она не только может «спрятать» РК от атак иммунной системы, но и перепрограммировать дифференцированную РК в РСК. Сложная смесь из факторов роста, хемокинов, гормонов и ферментов помогает РСК выжить и образовать метастаз.

У опухолевой клетки, попадающей в нишу, есть два пути. При неблагоприятных условиях она может перейти в состояние покоя, а при благоприятных — напротив, начать делиться и формировать метастаз. Предполагается, что РК может оставаться в нише, не делясь даже несколько десятков лет. Некоторые ученые выдвигают гипотезу, что покоящиеся метастазы присутствуют в организме с первой стадии рака, а не с четвертой (терминальной), как принято считать. В таком случае РК просто выжидает подходящего момента, а с изменением внешней среды «просыпается» и берется за работу.

Такое «переключение режимов» тоже регулируется молекулярным содержанием ниши и взаимодействием между МН и РК. Например, для регуляции состояния покоя, как показывают исследования, важен баланс между концентрацией белков семейства TGFβ и промитогенными цитокинами. У покоящихся клеток обнаружены и особые взаимодействия с внеклеточным матриксом — временная адгезия к его компонентам [23].

Как считают исследователи, терапия, нарушающая функцию микроокружения раковой клетки, очень перспективна. Например, если мишенью препарата станет МН, то можно добиться невероятных результатов: не только предотвратить появление метастазов, но и вылечить уже существующие. Но для этого сначала предстоит узнать больше о взаимодействии окружения и клетки, находящей приют в этой «тихой гавани».

Модели изучения микроокружения

Сегодня существует множество моделей изучения того, как микросреда изменяет отдельные клетки и их ДНК, и сопутствующее оборудование становится всё более компактным, автоматизированным и многофункциональным.

Раньше для выращивания клеток в культуре преимущественно использовались двухмерные (плоские) матрицы. На них было показано, что ограничением формы или подвижности клетки можно спровоцировать деление, апоптоз или даже дифференцировку мезенхимальных СК человека. Сейчас к этим моделям добавились и трехмерные модели из синтетических гидрогелей и матриц, основанных на коллагеновых волокнах. С их помощью удалось обнаружить, что у клеток, культивируемых в 2D- или 3D-окружении, различаются* фенотип, клеточно-матриксная адгезия и даже экспрессия генов.

* — О том, как чипы различных размеров и разной архитектурной сложности направляют дифференцировку мышиных нейрональных клеток-предшественниц в нейроны либо глию, можно прочитать в статье [24].

Для более корректного сравнения клеток, выращенных в двух- и трехмерной среде, разработаны специальные микролунки: одиночная клетка контактирует с плоской поверхностью, на которую нанесены адгезивные лиганды. Так, изменяя упругость подложки, можно манипулировать формой клетки в пространстве [25].

Близкий подход применяется для изучения метастатических ниш. Например, в 2013 году ученые создали модель спящих костных метастазов при раке груди. К этому исследователей подтолкнуло то, что примерно у трети больных раком груди уже на ранней стадии в костном мозге обнаруживают раковые клетки. Метастазы же развиваются только у половины из них — иногда спустя десятилетия после постановки диагноза. Возникло предположение, что «пробуждение» РК провоцируют факторы микросреды и (или) системные изменения. Эту гипотезу ученые и проверили на модели. 3D-коллагеновая биоматрица, в которой культивируют клетки костного мозга вместе с разными раковыми клетками, во многом воспроизводит естественную костную метастатическую нишу. Как оказалось, с помощью изменения ключевых сигнальных путей, отвечающих за переход клетки в состояние «спячки», можно манипулировать РК: искусственная ниша может и поддерживать, и ингибировать переход клеток в состояние покоя [26].

На похожей модели другая группа исследователей показала, что фармакологическое ингибирование сигналинга киназ определенного семейства не дает спящим клеткам рака груди вновь начать делиться. Поскольку для пролиферации нужна также активация другого гена, то параллельная терапия двумя ингибиторами вызывает апоптоз и задерживает рост метастазов. Авторы указывают, что такое комбинированное лечение может предотвратить повторное развитие рака молочной железы [27].

В наш век развития передовых биотехнологий было бы странно, если бы уже не были придуманы специальные приборы для отслеживания процессов опухолевой инвазии и эпителиально-мезенхимального перехода. К примеру, появились микрофлюидные технологии с различными механическими препятствиями и хемотаксическими градиентами. На одной из таких моделей обнаружено, что мигрирующая эпителиальная РК движется быстрее, если митохондрия находится в ее «головной» части [28].

Комбинированная система Polaris от Fluidigm Corp.

Микрофлюидика на службе исследователей клеточных ниш

Изучение единичных клеток с помощью биочипов на основе технологий микрофлюидики впервые было предложено в 2013 году, когда компания Fluidigm Corp. (США) анонсировала первый чип для профилирования гетерогенных популяций клеток [29]. Чип С1 TM позволил исследователю объединить захват отдельных клеток, лизис, обратную транскрипцию и амплификацию в единый автоматический протокол, тем самым решая большинство существующих проблем со скоростью эксперимента и надежностью и воспроизводимостью получаемых данных.

Довольно быстро биочипы заняли свою нишу во многих областях науки и медицины: изучении стволовых клеток, иммунологии, эпигенетике и, конечно, в онкологии. Так, с помощью биочипов была проведена одна из самых масштабных работ по определению клональности мутаций у пациентов с острым лимфобластным лейкозом. Результаты дали основания полагать, как именно происходило развитие заболевания в каждом конкретном случае [30].

В 2015 году Fluidigm Corp. анонсировала новую комбинированную систему Polaris TM , которая позволяла не только профилировать популяцию в целом, но и изучать влияние микроокружения на конкретные единичные клетки. На одном чипе теперь можно было выбрать клетки с интересующим иммунофенотипом, изолировать их в индивидуальных камерах и задать определенные параметры клеточной ниши.

Помимо манипуляций с потоками среды и газа, температурой и влажностью, в камеры клеток можно вводить дополнительные факторы, в том числе сигнальные молекулы, РНК, вирусы и бактерии. Такая свобода действий позволяет, во-первых, смоделировать практически любое клеточное состояние — апоптоз ли, пролиферацию, воспаление, гипоксию, дифференцировку или синтез специфических белков, а во-вторых, получать воспроизводимые и надежные результаты, гарантировать которые могут только приборы с высоким уровнем автоматизации. Более того, с того момента, как клетка попадает на чип, за каждым мгновением ее жизни ведется наблюдение, что позволяет напрямую соотносить изменения в микроокружении с фенотипом и экспрессией генов конкретной клетки.

Приборы типа Polaris TM открывают огромные перспективы в области изучения клеточного микроокружения, какую бы конечную цель не ставил перед собой исследователь — проверить эффективность нового лекарства, изучить новый сигнальный каскад или посмотреть, как меняется фенотип клетки в тех или иных условиях [31, 32].

Читайте также: