Иммуноферментный анализ (ИФА) — что это такое, как проводится, достоверность анализа

Обновлено: 25.06.2024

ИФА — это современное лабораторное исследование, в ходе которого ведется поиск специфических антител в крови (либо антигенов) к конкретным заболеваниям с целью выявления не только этиологии, но и стадии болезни.

В рутинной ветеринарной практике ИФА рекомендован в следующих случаях:

поиск специфических антител к любому инфекционному заболеванию;
поиск антигенов каких-либо инфекционных заболеваний;
исследование гормонального статуса пациента;
обследование на предмет наличия аутоиммунных заболеваний.

Как и у любого метода лабораторной диагностики ИФА имеет свои преимущества и свои недостатки. К преимуществам метода относятся:

высокая специфичность и чувствительность метода (более 90%);
возможность определения заболевания и отслеживания динамики процесса, то есть сравнение количества антител в разных временных промежутках;
доступность и скорость данного исследования;
не инвазивный способ забора материала не исследование;

Недостатком метода является тот факт, что в ходе анализа удается выявить не самого возбудителя заболевания, а только иммунный ответ на него (антитела).

Суть метода ИФА

Выделяют несколько разновидностей ИФА: прямой, непрямой, метод блокирования, конкурентный. Однако на практике чаще всего используется гетерогенный твердофазный иммунный анализ или ELISA.

Основу иммуноферментного анализа составляет иммунная реакция антигена и антитела с образованием иммунного комплекса, в результате чего происходит изменение ферментативной активности специфических меток на поверхности антител.

По сути, этот процесс можно разделить на несколько этапов:

на поверхности лунок планшета тест-системы находится очищенный антиген определенного возбудителя. При добавлении сыворотки крови животного происходит специфическая реакция между этим антигеном и искомым антителом;
далее, в лунку добавляется особый хромоген (конъюгат, меченный пероксидазой). Происходит ферментативная реакция, результатом которой является образование окрашенного вещества в лунке планшета. Интенсивность окраски его зависит от количества содержащихся в сыворотке животного иммуноглобулинов (антител);
далее происходит оценка результата. С помощью многоканального спектрофотометра, происходит сравнение оптической плотности исследуемого материала с оптической плотностью контрольных проб и математическая обработка результатов. Количество антител у пациента напрямую зависит от высоты оптической плотности данной лунки.

Нужно помнить: для каждой тест-системы разрабатываются индивидуальные показатели для учета результатов, показатели нормы и патологии («референтные значения»). Это нужно учитывать при оценке результатов каждого конкретного исследования.

Некорректно интерпретировать результаты одной лаборатории по «референтным значениям» другой лаборатории. Также некорректно сравнивать результаты разных лабораторий между собой.

При оценке результатов на конкретные инфекции имеет значение класс обнаруженных антител и их количество. От этого зависит не только вопрос этиологии инфекции, но и предполагаемая стадия заболевания (острая, хроническая), а также наличие активной инфекции (острой или обострения хронической) на момент обследования.

Каковы приблизительные сроки появления антител?

Самыми ранними антителами являются IgM. Выявить их можно через 1-3 недели после возможного инфицирования, что характеризует острую фазу инфекционного процесса. Вторая ситуация появления антител IgM - обострение хронического процесса. IgM циркулируют в среднем около 3х месяцев, затем их количество постепенно исчезает. Однако у некоторых пациентов следовые количества IgM могут обнаруживаться в течение 1-2х лет с момента инфицирования.

С 4й недели после инфицирования начинают появляться антитела IgG. При большинстве инфекций титр их постепенно увеличивается с максимумом в разные сроки (в среднем через 1,5-2 мес), далее титр остается на невысоком уровне и указывает на иммунитет. При некоторых заболеваниях уровень IgG не бывает высоким.

Диагностика вирусов и бактерий картофеля методом ИФА

И ммуноферментный а нализ (ИФА, англ. enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) - лабораторный метод качественного и количественного определения разнообразных молекул, вирусов, бактерий и т.п. В основе метода лежит высокоспецифичная иммунологическая реакция антитела и антигена.

Антителами являются сложные белковые молекулы (иммуноглобулины), синтезируемые клетками иммунной системы человека и прочих теплокровных животных в ответ на проникновение в организм антигенов - вирусов, бактерий, молекул и прочих чужеродных объектов. Высокая специфичность взаимодействия между антителом и антигеном обусловлена тем, что активный центр антитела способен связываться с уникальным фрагментом антигена. Именно это свойство реакции антитело-антиген определяет специфичность, надёжность, достоверность и чувствительность ИФА при проведении диагностики патогенов картофеля. При наличии целевого патогена в исследуемом образце формируется комплекс соответствующих антител и антигена, детекцию которого определяют по активности фермента, связанного с антителами.

Существует широкое разнообразие методов проведения ИФА, различающихся природой антигена, принципом связывания, условиями проведения, способами детекции результатов ферментативной реакции и т.п. Для диагностики патогенов сельскохозяйственных культур традиционно используется “сэндвич”-метод с использованием двух типов антител (DAS-ELISA - double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay). В качестве фермента, обычно, используется щелочная фосфатаза.

Проведение иммуноферментного анализа

Реакция проводится в 96-луночных полистирольных микропланшетах, характеризующихся высокой эффективностью связывания белковых молекул, в т.ч. иммуноглобулинов (антител), на своей поверхности.

На первом этапе антитела захвата (capture antobodies) разводят в необходимой концентрации в покровном буфере (coating buffer), вносят в лунки микропланшетов и инкубируют от нескольких часов при температуре +30-37°С до нескольких дней при температуре +4°С. Во время инкубирования антитела неспецифически адсорбируются на поверхности лунок микропланшета. По окончании инкубирования планшеты промывают несколько раз промывочным буфером (wash buffer) для удаления антител захвата, которые не связались с поверхностью микропланшета.

Сорбция антител захвата на поверхности лунки микропланшета

На следующем этапе в лунки микропланшета, поверхность которых покрыта антителами захвата, вносят сок, экстракт, или гомогенат растений, исследуемых на наличие антигенов - патогенных бактерий или вирусов и инкубируют 14-16 часов при температуре +4°С. При необходимости, растительный материал можно развести экстракционным буфером (extraction buffer). По окончании инкубирования лунки несколько раз промывают промывочным буфером.

При наличии целевого патогена в образце происходит взаимодействие специфичного фрагмента антигена с соответствующим антигенсвязывающим центром антител захвата.

Связывание антигена с антителами захвата

В промытые лунки наносят антитела детекции, конъюгированные с ферментом щелочная фосфатаза (Ф). Антитела разводят в необходимой концентрации в конъюгатном буфере (conugation buffer). Микропланшеты инкубируют при температуре +30°С в течение 5 часов. По окончании инкубирования микропланшеты несколько раз промывают промывочным буфером для удаления антител детекции, не связавшихся с антигенами.

На данном этапе происходит взаимодействие специфичного фрагмента антигена с соответствующим антиегнсвязывающим центром антител детекции. Антигенсвязывающие центры антител захвата и антител детекции различны и специфично связываются с разными фрагментами антигена.

Связывание антител детекции с антигеном

На заключительном этапе в лунки добавляют пара-нитрофенилфосфат, являющийся субстратом для фермента щелочная фосфатаза. При наличии в растительном образце целевых патогенов формируется комплекс антитело захвата-антиген (вирус или бактерия)-антитело детекции, конъюгированное с ферментом щелочная фосфатаза. Фермент (Ф) катализирует превращение бесцветного пара-нитрофенилфосфата (субстрат, С) в жёлтый пара-нитрофенол (продукт, П), в результате чего происходит окрашивание реакционной смеси в жёлтый цвет. Интенсивность окраски реакционной смеси можно оценивать как визуально, так и с помощью спектрофотометра.

Фермент, конъюгированный с антителами детекции, катализирует реакцию превращения бесцветного субстрата в жёлтый продукт

Оформите заявку на сайте, мы свяжемся с вами в ближайшее время и ответим на все интересующие вопросы.

Иммуноферментный анализ крови — это один из способов лабораторной диагностики, который основан на реакции под названием «антиген-антитело».

Антиген — это чужеродное белковое соединение (молекула), попавшее в организм человека с бакториальной, вирусной или другой инфекцией. То есть, попросту вредитель. В свою очередь антитело — это иммунная клетка (иммуноглобулин), встающая на защиту организма человека при обнаружении в нем чужеродных молекул.
Выработку антител провоцируют сами же антигены, проникшие в организм человека. При вступлении в «битву» за здоровье организма антитела как бы помечают собой антигены, что при исследовании крови и видит лаборант. То есть в забранном биоматериале можно отследить не только наличие инфекции, но и ее следы уже после того, как организм полностью выздоровел.
При проведении анализа на ИФА врач клинической лабораторной диагностики может видеть такие иммуноглобулины к антигенам:

Иммуноглобулины М (в результатах значатся как IgM). Свидетельствуют о том, что инфекционный процесс в организме только набирает свою силу. То есть инфицирование произошло совсем недавно;
Иммуноглобулины G (значатся как IgG). Способствуют уничтожению антигенов через несколько дней после внедрения инфекции в организм человека. Иммуноглобулины G могут находиться в организме пациента достаточно долго, формируя иммунитет к определенному возбудителю;
Иммуноглобулины Е (значатся как IgЕ). Свидетельствуют о паразитарных инфекциях в организме. Он же говорит и об атопических реакциях при аллергии.

Комбинированное выявление антител к ВИЧ типов 1 и 2 и антигена р24 ВИЧ, качественный тест. ВИЧ (вирус иммунодефицита человека), вызывающий СПИД (синдром приобретенного иммунодефицита) - принадлежит к семейству ретровирусов. Передается от человека к человеку при использовании загрязненных игл и шприцев для внутривенного введения наркотиков или терапевтических процедур, при сексуальных контактах, как гетеро, так и гомосексуальных. Передача вируса может произойти при переливании инфицированной крови и ее продуктов, донорстве органов или семенной жидкости, у медицинских работников - при ранении инфицированными иглами или инструментами. Заражение ВИЧ возможно путем его передачи от инфицированной матери ребенку (вертикальный путь), хотя современные методы профилактики с применением антиретровирусной терапии, при выполнении всех рекомендаций, позволяют снизить такой риск до минимума. Присутствие ВИЧ со временем вызывает нарушение иммунной системы из-за избирательного уничтожения им иммунокомпетентных клеток. Это приводит к снижению иммунитета против вирусных, бактериальных, грибковых, протозойных, паразитарных, опухолевых заболеваний - развитию синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД). В соответствии со статистикой, раннее выявление инфекции и применение современной терапии значительно улучшают показатели выживаемости. БЕСПЛАТНО

Основной маркер вирусного гепатита В Это наиболее ранний маркер гепатита В, появляющийся еще в инкубационном периоде заболевания, до повышения уровня ферментов крови. Содержание HBsAg в крови инфицированных пациентов колеблется в широких пределах и часто достигает очень высокого уровня. Этот маркер при коротком инкубационном периоде заболевания может обнаруживаться в крови уже через 6 дней с момента инфицирования. Далее, при остром течении гепатита, HBsAg выявляется в крови в течение 5-6 месяцев и затем исчезает - последним из вирусных антигенов. Обнаружение поверхностного антигена вируса гепатита В в крови дольше 6 месяцев после начала болезни свидетельствует о вероятности того, что гепатит В перешел в хроническую форму. Возможно пожизненное носительство HBsAg. Тестирование крови на присутствие HBsAg используют для подтверждения диагноза гепатита В, для контроля за состоянием пациентов с этим заболеванием (то есть для выяснения, произошло ли выздоровление или переход в хроническое носительство), для исследования донорской крови и препаратов крови на присутствие HBsAg в целях исключения переноса вируса гепатита В реципиентам.

Высокоспецифичный маркёр системной красной волчанки. Анти-дсДНК - один из видов антинуклеарных антител. Присутствие этих антител высокоспецифично для системной красной волчанки (СКВ), реже и в более низкой концентрации они встречаются при других диффузных болезнях соединительной ткани или лекарственно-индуцированной СКВ. Предполагается непосредственное участие анти-дсДНК IgG антител в патогенезе развития васкулитов и волчаночного нефрита. Уровень анти-дсДНК антител у пациентов с СКВ прямо коррелирует с концентрацией IgG-содержащих циркулирующих комплексов (ЦИК), они присутствуют в повышенной концентрации в почечных клубочках у больных СКВ при тяжёлой почечной патологии. Показано, что дсДНК обладает способностью связываться с базальной мембраной почечных клубочков, что может вызывать образование иммунных комплексов непосредственно в клубочках. Накопление иммунных комплексов ведёт к активации комплемента (с потреблением его сывороточных резервов) и развитию воспаления и повреждения тканей. Количественное определение анти-дсДНК IgG антител (ежемесячно) целесообразно использовать в целях мониторинга состояния, прогноза и контроля терапии у пациентов СКВ. Уровень анти-дсДНК IgG антител у пациентов с СКВ коррелирует с тяжестью гломерулонефрита. Концентрация антител варьирует соответственно изменениям активности СКВ. Выраженное нарастание уровня анти-дсДНК IgG антител в течение нескольких недель и снижение содержания комплемента (см. тест № 193 - компоненты комплемента С3, С4) в большинстве случаев являются предвестниками клинического обострения. Непосредственно в момент обострения гломерулонефрита уровень антител может снижаться. У части пациентов с СКВ анти-дсДНК антитела не выявляются. Таким образом, отрицательный результат теста не всегда исключает заболевание. В единичных случаях (менее 2%) анти-дсДНК IgG антитела в низкой концентрации могут наблюдаться у людей без каких-либо клинических симптомов аутоиммунного заболевания.

Специфический трепонемный тест, использующийся в диагностике сифилиса для выявления свежей инфекции. Специфические антитела класса IgM к возбудителю сифилиса Treponema pallidum присутствуют у большинства пациентов с первичным и вторичным сифилисом (соотв. 88% и 76%), на ранней латентной стадии они наблюдаются уже у менее 20% пациентов, поэтому определение IgM может использоваться для различения свежей или давней инфекции. Сероконверсия (появление специфических IgM антител у ранее серонегативного пациента), а также значительный прирост титров в парных сыворотках, взятых с интервалом 7 дней подтверждают первичную инфекцию. Специфические IgM антитела отсутствуют у пролеченных в прошлом пациентов, но отсутствие специфических IgM антител само по себе не говорит об адекватности проведённого лечения, поскольку у большинства больных, не получавших лечения, в латентной стадии процесса IgM антитела также отсутствуют. Исследование IgM антител может быть целесообразным в диагностике врождённого сифилиса. Риск передачи инфекции от матери к ребёнку во время беременности или при родах существенно выше у беременных со свежей инфекцией, о которой могут свидетельствовать присутствие IgM антител и высокие титры RPR (см. тест № 69) в крови беременной женщины. Материнские IgM антитела, в отличие от IgG антител, не проходят от матери к ребёнку через плаценту, поэтому обнаружение антител класса IgM к Treponema pallidum в крови новорожденного поможет подтвердить диагноз

Определение антител класса IgG к treponema pallidumв сыворотке крови, ликворе (полуколичественное исследование)

Определение антител класса IgG к treponema pallidumв сыворотке крови, ликворе (качественное исследование)

Определение антител классов М, G (IgM. IgG) к антигену вирусному гепатиту С (Hepatitis С virus) в крови

Показатель, характеризующий наличие антител (независимо от класса М и G) к вирусу гепатита C. Антитела класса М начинают вырабатываться через 4 - 6 недель после инфицирования, их концентрация быстро достигает максимума. По прошествии 5 - 6 месяцев уровень IgM падает и повышается вновь во время следующей реактивации инфекции. Антитела класса G появляются с 11 - 12 недели после инфицирования, достигают пика концентрации к 5 - 6 месяцу и сохраняются в крови на более-менее постоянном уровне в течение всего периода болезни и реконвалесценции. Таким образом, суммарный уровень антител определяется с 4 - 5 недели после инфицирования и далее. Гепатит С передается с кровью и биологическими жидкостями парентеральным, половым и трансплацентарным путями. Группу повышенного риска составляют лица, практикующие внутривенную наркоманию, беспорядочные половые связи, а также медицинские работники, пациенты, нуждающиеся в гемодиализе или переливаниях крови, заключенные. Проникая в организм, HCV попадает в макрофаги крови и гепатоциты печени, где происходит его репликация. Повреждение печени происходит в основном за счет иммунного лизиса, также вирус оказывает прямое цитопатическое действие. Сходство антигена вируса с антигенами системы гистосовместимости человека обусловливает возникновение аутоиммунных ("системных") реакций. В программе системных проявлений HCV-инфекции могут возникать аутоиммунный тиреоидит, синдром Шегрена, идеопатическая тромбоцитопеническая пурпура, гломерулонефрит, ревматоидный артрит и др. По сравнению с другими вирусными гепатитами, гепатит С имеет менее яркую клиническую картину, чаще переходит в хронические формы. В 20 - 50% случаев хронический гепатит С приводит к развитию цирроза печени и в 1,25 - 2,50% - к развитию гепато-целлюлярной карциномы. С высокой частотой возникают аутоиммунные осложнения. Инкубационный период - 5 - 20 дней. В конце инкубационного периода повышаются уровни печеночных трансаминаз, возможно увеличение печени и селезенки. Острый период протекает со слабостью, снижением аппетита. В трети случаев возникает лихорадка, артралгия, полиморфная сыпь. Возможны диспептические явления и полинейропатии. Холестаз возникает крайне редко (5% случаев). Лабораторные показатели отражают цитолиз. При высоком уровне трансаминаз (более 5 норм) и признаках печеночно-клеточной недостаточности следует заподозрить микст-инфекцию: HCV+HBV.

Читайте также: