Механизмы активации каспаз апоптоза

Обновлено: 17.05.2024

Само название этого типа клеточной смерти – апоптоз, что в переводе с греческого означает «падающие листья», говорит о том, что он является такой же естественной и неотъемлемой чертой многоклеточного организма, как сезонная смена листвы для деревьев. Апоптоз запускается, когда клетка имеет серьезные повреждения, ведущие к нарушению ее функций: в результате слаженной работы специальных систем, необратимо повреждающих основные клеточные структуры, такая клетка заканчивает жизнь «самоубийством».

Все клетки многоклеточных существ несут в себе потенциальную способность к апоптозу, так же как японские самураи всю жизнь носят с собой меч. И если по каким-то причинам тонкий механизм апоптоза разлаживается, последствия для организма могут оказаться самыми катастрофическими. Например, раковые клетки, блокируя систему апоптоза, приобретают бессмертие. Поэтому изучение механизмов клеточной самоликвидации является важнейшим направлением современных биомедицинских исследований: раскрытие тайн апоптоза поможет в разработке новых лекарств для борьбы с самыми тяжелыми и трудноизлечимыми болезнями современности

Каждый день и каждый час в нашем организме погибают миллионы клеток. Отшелушиваются ороговевшие клетки покровного эпителия, быстро изнашиваются и гибнут клетки слизистой ткани, выстилающей пищеварительный тракт, лейкоциты – белые клетки крови, находят свою смерть в борьбе с патогенами… Но как наше тело избавляется от специализированных клеток, когда в результате накопившихся внутренних повреждений они становятся неспособными выполнять свои функции? Одним из самых парадоксальных и удивительных механизмов, контролирующих жизнеспособность многоклеточного организма, является апоптоз – клеточная самоликвидация.

Регулярная, генетически запрограммированная гибель отдельных клеток необходима для нормального функционирования организма в целом. Все клетки многоклеточных существ обладают аппаратом апоптоза, так же как японские самураи всю жизнь носят с собой меч. Однако у этого естественного процесса есть и обратная сторона: если по каким-то причинам тонкий механизм апоптоза разлаживается, последствия для организма могут оказаться самыми катастрофическими.

Нарушения в запуске апоптоза ведут к возникновению ряда серьезных заболеваний, в том числе аутоиммунных и онкологических. Например, раковые клетки, блокируя систему апоптоза, приобретают бессмертие. Поэтому изучение механизмов клеточной самоликвидации является важнейшим направлением современных биомедицинских исследований: раскрытие тайн апоптоза поможет в разработке новых лекарств для борьбы с самыми тяжелыми и трудноизлечимыми болезнями современности.

Ферменты-киллеры

Итак, клетка выполнила свои функции, «постарела» и готова к самоуничтожению во благо всему организму. Кто же выполняет это «заказное» самоубийство?

Оказывается, в этом «детективе» про апоптоз имеются и свои затаившиеся киллеры. В этой роли выступают особые ферменты – каспазы, имеющиеся в каждой клетке (Salvesen, 2002; Nicholson, 1999; Lavrik et al., 2005). Обычно каспазы присутствуют в клеточной цитоплазме в виде неактивных предшественников (прокаспаз). Прокаспазы не проявляют никакой активности, мирно сосуществуя в клетке вместе с другими белками, однако при поступлении сигнала на самоуничтожение они превращаются в настоящие белки-убийцы.

«Смена имиджа» безобидных прокаспаз происходит так: белок расщепляется на три фрагмента, один из которых (продомен) отщепляется, а остальные соединяются с двумя аналогичными фрагментами другой прокаспазы. Благодаря такой структурной перестройке образуется активный гетеротетрамер каспазы, в котором аминокислоты формируют центр фермента, выполняющий каталитическую функцию (Salvesen, 2002).

Образовавшиеся активные каспазы наконец показывают свое настоящее лицо: они начинают расщеплять все белки, которые содержат остатки аминокислоты аспарагина (при условии, что рядом располагаются определенным образом остатки еще трех других аминокислот). В результате такой «подрывной» деятельности в клетке оказываются поврежденными сотни белков. К числу наиболее известных мишеней каспаз относятся белки цитоскелета (структурного каркаса клетки); белки, отвечающие за репарацию (восстановление) поврежденной ДНК; структурные белки оболочки клеточного ядра, а также ряд других жизненно важных белков. Все это приводит к нарушению всех процессов жизнедеятельности клетки.

В то же время каспазы активируют ряд белков, которые участвуют в выполнении программы самоликвидации. Например, белка, который разрезает ДНК на большие фрагменты, – этот процесс, после которого целостность ДНК необратимо уничтожается, является характерной чертой апоптоза.

Сигнал на запуск

Но каким же образом клетка узнает, что ей пора самоликвидироваться? Кто и как дает указания киллерам-каспазам?

Имеется два основных пути, по которым передаются апоптопические сигналы в виде клеточных регуляторов, таких как гормоны, антигены, моноклональные антитела и другие молекулы. Это митохондриальный (или внутренний) путь, а также через особые трансмембранные белки – так называемые рецепторы смерти (DR, от англ. death receptor). В обоих случаях для запуска апоптоза должны образоваться особые инициаторные апоптотические комплексы. Затем происходит активация так называемых инициаторных каспаз, которые, в свою очередь, активируют эффекторные (разрушающие клеточные структуры) каспазы, о которых упоминалось выше (Nicholson, 1999).

Митохондриальный путь инициируется в результате интенсивного воздействия на клетку ряда повреждающих факторов. Однако каким образом эти повреждения трансформируются в митохондриальный апоптотический сигнал, пока в деталях не установлено. Тем не менее достоверно известно, что первым шагом на этом пути является выход из митохондрий («энергетических фабрик» клетки) цитохрома С – небольшого белка, содержащего комплекс с железом, который является компонентом митохондриальной дыхательной цепи (Green et al., 2004).

Выход цитохрома С инициирует образование в цитоплазме клетки крупного белкового комплекса – апоптосомы, в которую, помимо самого митохондриального белка, входят прокаспаза-9 и белок АПАФ-1. Именно апоптосома и является настоящим «мафиозным боссом» митохондриального пути апоптоза, который дает сигнал киллерам-каспазам.

Речь идет об очень интересном явлении – самоактивации прокаспазы. Такое может произойти лишь в том случае, когда две молекулы этого белка, ориентированные определенным образом относительно друг друга, образуют димер. Именно такие уникальные пространственные условия, необходимые для димеризации и каталитической активации фермента, и предоставляет прокаспазе-9 апоптосома. Образовавшаяся в результате активная каспаза-9 расщепляет эффекторные каспазы (каспазу-3 и каспазу-7), а дальше все происходит по стандартной схеме апоптоза (Green et al., 2004).

В случае рецептор-зависимого сигнального пути инициация апоптоза начинается с другого белкового комплекса, который образуется непосредственно на самом рецепторе смерти (Krammer et al., 2007; Lavrik et al., 2005).

К настоящему времени семейство таких рецепторов включает шесть представителей, в том числе рецептор такого широко известного белка, как фактор некроза опухоли. Все рецепторы смерти имеют одинаковый фрагмент из 80 аминокислот – так называемый домен смерти, расположенный на белковом «хвостике», выходящем в цитоплазму клетки. Такой же аминокислотный фрагмент имеет и белок-адаптер FADD, находящийся в цитоплазме клетки. Домены смерти могут взаимодействовать между собой с образованием устойчивой связи; FADD, в свою очередь, способен присоединять к себе прокаспазу.

Вся цепь событий по образованию апоптотического комплекса запускается лигандом смерти – белком-агонистом, способным специфично связываться с рецептором смерти. Синтез (и, соответственно, рост концентрации) таких молекул в клетке стимулируется каскадом процессов, возникающих в ответ на повреждение клетки. В результате, благодаря посредничеству FADD, на рецепторе образуется комплекс DISC (от англ. death-inducing signaling complex), что в дословном переводе означает «сигнальный комплекс, инициирующий гибель». Именно в этом комплексе, как и в апоптосоме, происходит самоактивация прокаспазы-8, которая, в свою очередь, активирует эффекторные каспазы (каспазу-3 и каспазу-7) и инициирует клеточную гибель (Lavrik et al., 2005; Krammer et al., 2007). Собственно говоря, на этом различия между запуском двух сигнальных путей апоптоза заканчиваются.

Жить или не жить?

Нужно отметить, что любая клетка организма постоянно подвергается многочисленным повреждающим воздействиям, таким как радиационное излучение разных типов, разнообразные химические агенты, недостаток питательных веществ и т. п. К счастью для нас, для полноценной инициации клеточной гибели необходимо сравнительно сильное воздействие. На страже апоптотических путей стоят специфические механизмы, играющие роль «регулировщиков движения». Эту роль играют особые белки XIAPs и FLIP (Lavrik et al., 2005).

Белки XIAPs ингибируют каспазу-9, которая активируется вследствие развертывания митохондриального пути. Связываясь с активным центром каспазы, они не дают «киллеру» выполнять свою работу. Однако с помощью этих белков клетке удается заблокировать лишь небольшое число активных каспаз. Если же концентрация активных каспаз превышает некий пороговый уровень, то белков XIAPs становится недостаточно, и процесс апоптоза остановить уже невозможно.

В случае рецепторзависимого сигнального пути апоптоза ингибитором активации прокаспазы-8 служит близкий ей по структуре белок FLIP. Молекулы этого белка также могут связываться с апоптическим комплексом DISC, конкурируя за «место» с молекулами прокаспазы, – при повышенной концентрации в цитоплазме они блокируют все возможные «места» такого связывания (Krammer et al., 2007). В результате прокаспаза-8 не может быть активирована, и апоптоз не запускается.

Нарушения в уровне экспрессии как про- так и антиапоптотических белков может привести к серьезным отклонениям от обычного образа жизни клетки. Так, повышенный уровень экспрессии белков XIAPs и FLIP имеют многие раковые клетки. Выбрав курс на собственное бессмертие, в конечном счете они приводят к гибели все многоклеточное «сообщество» организма.

Итак, в отличие от голливудского детектива, в истории про апоптоз нет главного действующего лица: своевременное уничтожение поврежденных клеток и в итоге – жизнеспособность организма зависит от слаженной цепочки событий, в которой участвует множество различных белковых молекул.

И здесь очень важны количественные показатели, такие как концентрация. Сегодня изучением того, как влияет на инициацию и дальнейший ход апоптоза уровень содержания в клетке различных молекул, занимается одна из передовых областей современной науки – системная биология (Bentele et al., 2004). Основной ее постулат заключается в том, что протекание сложных процессов внутри клетки можно понять, лишь учитывая максимально большое число клеточных параметров. Для этого на основе экспериментальных данных создается компьютерная модель, которая учитывает действие множества факторов. Полученные таким образом предсказания о ходе основных клеточных процессов могут использоваться в борьбе с препятствиями человечества на пути к долгой и здоровой жизни.

Lavrik I. N., Golks A., Krammer P. H. Caspases: Pharmacological manipulation of cell death // J. Clin. Invest. 2005. V. 115, N 10. P. 2665—2672.

Krammer P. H., Arnold R., Lavrik I. N. Life and death in peripheral T cells // Nat. Rev. Immunol. 2007. V. 7. P. 532—542.

Green D. R. and Kroemer G. The pathophysiology of mitochondrial cell death // Science. 2004. V. 305. P. 626—629.

Ученые МГУ исследовали механизмы влияния модификаций белков на апоптоз

Влияние модификации каспаз на результат терапии опухолевых клеток. Источник: Борис Животовский

Сотрудники факультета фундаментальной медицины МГУ имени М.В.Ломоносова описали молекулярные механизмы влияния посттрансляционных модификаций белков семейства каспаз на процесс их активации и протекание программируемой клеточной гибели — апоптоза. Результаты исследования опубликованы в журнале Trends in Cell Biology.

Организм всех известных живых существ постоянно требует очистки от «лишних» клеток, которые уже выполнили свою функцию или стали опасны в результате повреждений генетического материала, вызываемых, например, различными токсическими веществами, ультрафиолетовой радиацией и другими причинами. Самоуничтожение таких потенциально опасных клеток известно как процесс программируемой гибели клеток, один из видов которого — апоптоз. Он позволяет поддерживать тканевой гомеостаз, замещать старые клетки новыми. Известно, что в течение 70 лет жизни эпителий кишечника обновляется примерно 4000 раз, и если выполнившие свои функции клетки не уничтожаются, то за 70 лет длина кишечника может составить 32 километра. За те же 70 лет организм производит примерно 3 тонны клеток костного мозга.

«Нарушения в механизме запуска и протекания апоптоза приводят к самым нежелательным последствиям для организма. Так, избыточная клеточная смерть уничтожает нейроны, приводя наш мозг в состояние, при котором сначала теряется кратковременная память, а потом и долговременная, страдает крупная и мелкая моторика, развиваются психозы. Развитие болезни Альцгеймера, Паркинсона, бокового амиотрофического склероза, хореи Хантингтона в той или иной степени связано с повышенной апоптотической гибелью клеток. Кроме того, чрезмерная гибель может вызывать гематологические, иммунные, метаболические заболевания. Однако один из самых печальных примеров заболеваний, связанных с нарушениями апоптоза, характеризуется его недостаточностью. Клетка, получившая мутацию, в норме должна запустить процесс самоуничтожения, но слабый контроль и нарушения в апоптотических механизмах вызывают появление злокачественных образований», — говорит профессор Борис Животовский, руководитель лаборатории исследования механизмов апоптоза, в которой была выполнена работа.

Запуск и протекание апоптотических процессов на молекулярном уровне обеспечивают специальные белки-ферменты — цистеиновые протеазы, или каспазы. В норме эти ферменты существуют в виде неактивной проформы и должны претерпеть ряд расщеплений для формирования активного тетрамера. Сигналом для запуска программы самоуничтожения клетки может стать огромное количество разнообразных стимулов: связывание определенных молекул с «рецепторами смерти» на поверхности клетки, повреждение ДНК, накопление неправильно свернутых белков, отсутствие питательных веществ, появление в клетке активных форм кислорода, нагревание. Все вышеуказанные факторы способствуют запуску серии последовательных реакций активации каспаз, или каспазному каскаду. Понимание деталей процессов регуляции каспаз тесно связано с возможностью рационально манипулировать апоптозом с целью получения терапевтических преимуществ. Вся цепочка реакций начинается с расщепления так называемых инициаторных каспаз, которые активируют эффекторные каспазы. Появление активных протеаз в клетке приводит к разрушению большинства клеточных структур, деградации ядра и распаду клетки на апоптотические тельца. Однако эта сложная система требует тщательного контроля, поскольку случайная активация каспаз может привести к печальным последствиям для клетки.

«Многие белки и секретируемые пептиды претерпевают различные структурные изменения в результате посттрансляционных модификаций (ПТМ), то есть после завершения их синтеза рибосомами. Посттрансляционные модификации заключаются в ковалентной модификации белков после завершения их синтеза рибосомами. Данный процесс играет ключевую роль в создании гетерогенности белков, в исключении идентичных белков, их деградации, тканеспецифичных механизмов действия и регуляции их активности. Благодаря ПТМ один белок может выполнять разные функции в клетке одного и того же организма. Таким образом, ПТМ создает дополнительный тонкий уровень регуляции функции белка, позволяющий более динамично реагировать на изменения, происходящие в клетке. Модификации происходят в эндоплазматическом ретикулуме и аппарате Гольджи. Например, специальные белки — киназы — переносят остатки фосфорной кислоты на определенный аминокислотный остаток в молекуле каспазы, что приводит к изменению структуры белка и ингибированию или, наоборот, активации его функций. Фосфорилирование каспаз, подробно проанализированных в опубликованной работе, приводит в подавляющем большинстве случаев к изменению конформации активного центра и, соответственно, ингибирует активность этих белков, подавляя тем самым процесс апоптоза», — поясняет Алексей Замараев, аспирант лаборатории и первый автор статьи.

«Посттрансляционные модификации играют ключевую роль в регуляции процесса активации и последующей активности каспаз, играя тем самым роль переключателей между программируемой гибелью клеток и их выживанием, что было четко продемонстрировано в материалах статьи», — говорит Евгения Прохорова, студентка МГУ, участница проекта.

«Один из важнейших выводов был сделан на основе биоинформатического анализа, который впервые показал высокую консервативность определенных сайтов фосфорилирования каспаз, расположенных вблизи активного центра этих протеаз, что дает ключ к пониманию общих принципов регуляции функционирования этих ферментов и их роли в регуляции апоптоза», — рассказывает Инна Лаврик, ведущий автор статьи, доктор химических наук, профессор, ведущий научный сотрудник лаборатории исследования механизмов апоптоза факультета фундаментальной медицины МГУ.

Для написания статьи ученые провели анализ более 250 источников, который выявил основные типы посттрансляционных модификаций с классификацией их на отдельные типы. Особое внимание уделялось тому, в каких условиях происходят такие модификации и к чему они приводят — к активации или, наоборот, к ингибированию действия каспаз. Помимо литературной работы, был проведен сравнительный биоинформатический анализ аминокислотных последовательностей каждой каспазы у позвоночных и беспозвоночных организмов. Кроме того, проведено сравнение участков посттрансляционных модификаций на основании третичной структуры белка. Такой анализ помог не только выявить консервативные аминокислотные остатки, которые подвергаются модификациям, но и предсказать новые. Более того, биоинформатический анализ позволил сделать заключение о высокой схожести некоторых сайтов фосфорилирования каспаз у эволюционно далеких организмов.

На основе полученных данных стало возможным предсказать новые, не описанные в литературе сайты модификации каспаз. Кроме того, полученные данные могут быть использованы для дизайна специфических ингибиторов либо активаторов, способных регулировать активность каспаз, для применения в лечении болезней, таких как нейродегенеративные и раковые заболевания, связанные с дисфункциями этих протеаз.

«На сегодняшний день существуют противораковые препараты, блокирующие активность определенных групп киназ (ферментов, осуществляющих посттрансляционное фосфорилирование), — так называемые ингибиторы тирозинкиназ (например, Afatinib, Bosutinib и т. д.). Данные препараты подавляют активность разных групп тирозинкиназ, стимулирующих рост злокачественных клеток. При этом запускается путь апоптоза, приводящий к активации каспаз. Кроме того, в настоящее время для лечения некоторых гематологических опухолей рекомендовано применение препарата Venetoclax (ABT-199), который подавляет функцию антиапоптотических белков и также вызывает активацию каспаз. Несколько фармацевтических фирм работает над созданием нового класса лекарств — ингибиторов киназ, которые будут способны негативно влиять на активность каспаз, подавляя тем самым апоптоз, что необходимо для лечения нейродегенеративных заболеваний», — заключает Галина Копеина, ведущий научный сотрудник лаборатории, участник проекта.

Механизмы активации каспаз апоптоза

Гибель клеток при метаморфозе, эндокринозависимой атрофии тканей и в процессе удаления стареющих, избыточных или аномальных клеток называется апоптозом. Это запрограммированная клеточная гибель - естественный процесс, который находится под контролем генетической регуляции. Одним из внеклеточных факторов, запускающих в клетке апоптоз, является Fas-лиганд (FasL). Белок Fas/АРО-1, также называемый CD95, относится к семейству рецепторов фактора некроза опухоли (TNF). Степень активации рецептора Fas различными лигандами зависит от микроокружения клеток. Активация каспаз - необходимый этап Fas-опосредованного апоптоза. В дендритных клетках активация рецепторов Fas вызывает их фенотипическое и функциональное созревание. Fas-опосредованная дифференцировка клеток иммунной системы (ИС) сопровождается секрецией провоспалительных цитокинов TNF, ИЛ-1b, ИФg, что указывает на участие Fas-системы в реализации иммунного ответа (ИО) организма при воспалении. Рецептор Fas выявлен в клетках многих типов тканей. FasL экспрессирован преимущественно в активированных Т-лимфоцитах и ЕК-клетках. Большинство незрелых Т-клеток неспособны осуществлять свои функции из-за дефекта Т-рецепторов или аутоагрессивны для организма, и потому уничтожаются в тимусе или на периферии (клональная селекция). Fas участвует в самоликвидации активированных Т-клеток и, следовательно, в подавлении избыточного ИО. Факты предполагают участие Fas-системы в удалении активированных или аутоагрессивных В-клеток.

Установлено, что функционально активными цитотоксическими Т-лимфоцитами (ЦТЛ) являются CD8+ Т-клетки, но CD4+ Т-клетки Th-1-типа также проявляют цитотоксичность, распознают и уничтожают опухолевые клетки, а также инфицированные вирусами или бактериями. ИО клеток и воспалительные реакции могут вызвать неспецифическое повреждение близлежащих тканей.

Показано, что нормальное функционирование Fas-системы поддерживает клеточный гомеостаз в организме. Потеря функциональной активности Fas-системы вызывает гиперплазию лимфоидных органов и развитие лимфопролиферативных процессов. Отклонение от нормы и выживание лимфоцитов позволяет клеткам накапливать мутации, приводящие к злокачественным новообразованиям.

Обнаружены: повышенный уровень рецептора Fas у больных системной красной волчанкой и другими аутоиммунными заболеваниями, а также нарушения элиминации активированных лимфоцитов, что обусловлено ингибированием Fas-зависимого апоптоза. То же выявлено в сыворотке крови больных с опухолевыми новообразованиями. Характерно повышение концентрации рецептора Fas при метастазировании и его снижение после оперативного удаления опухолей. FasL, локализованный на поверхности опухолевых клеток, взаимодействует с Fas-положительными ЦТЛ и ЕК-клетками, индуцируя апоптоз последних. Этот механизм является одной из причин подавления противоопухолевого иммунитета. Вероятно, ЦТЛ активируются при распознавании вирусных антигенов на поверхности инфицированных клеток печени, и их элиминация осуществляется с помощью Fas/FasL взаимодействия.

Перспективы клинического использования знаний о Fas-системе заключаются в возможности блокирования индуцированной FasL элиминации здоровых клеток. Нейтрализующие моноклональные антитела против Fas (или FasL) и другие ингибиторы Fas-опосредуемого апоптоза могут найти терапевтическое применение при гепатитах, СПИДе и других заболеваниях, связанных с ЦТЛ-индуцированным повреждением тканей. Однако необходимо балансировать между двумя крайностями - деструкцией тканей, вызываемой mFasL, и воспалительными реакциями, причиной которых является повышенная концентрация рецептора sFasL. При трансплантации можно использовать FasL в качестве иммуносупрессивного агента. Перспективным направлением является противоопухолевая терапия. Повышенная продукция некоторыми типами опухолевых клеток sFas лежит в основе их резистентности к ЦТЛ- и ЕК-индуцированной Fas-зависимой элиминации. Выявление факторов, влияющих на механизмы альтернативного сплайсинга мРНК рецептора Fas, может обеспечить выбор препаратов, ингибирующих sFas и повышающих чувствительность опухолевых клеток к Fas-опосредуемому апоптозу.

Таким образом, Fas-система играет важную роль в регуляции гомеостаза и функционировании клеток ИС, и углублённое изучение апоптоза важно для познания патогенеза многих заболеваний. Физиологическое значение лигандов рецептора Fas проявляется не только в индукции апоптоза, но и в инициации регуляторных сигналов, активирующих пролиферацию и дифференцировку иммунокомпетентных клеток. Нарушения клеточного гомеостаза в ИС приводят к развитию различных патологических состояний. Новые подходы к управлению иммунопатологическими процессами путём влияния на Fas-систему могут способствовать созданию иммуномодулирующих препаратов, способных регулировать атипичный или восстанавливать дефектный физиологический апоптоз. Поэтому факторы, регулирующие активность Fas-системы, могут найти широкое клиническое применение, с учётом их ростостимулирующего и цитодифференцирующего потенциала.

Произошёл значительный сдвиг представлений о гибели клеток. Ранее считалось, что гибель клеток является пассивной и неспецифической. В настоящее время установлено, что она относится к активным биохимическим процессам. Гибель клеток во время эмбриогенеза, метаморфозов, эндокриннозависимой атрофии тканей и в процессе удаления стареющих, избыточных или аномальных клеток называется апоптозом. При апоптозе происходит аутодеградация основных компонентов клетки, обусловленная действием внутриклеточных протеаз и эндонуклеаз. Обнаружение экзогенных инициаторов апоптоза и их рецепторов на поверхности клетки свидетельствует, что в ряде случаев апоптоз индуцируется извне. Обнаружено, что пролонгированные клеточные стрессы, в том числе оксидантный, и повреждение ДНК, могут запускать апоптоз. Его могут индуцировать нарушения путей передачи сигнала. Для идентификации апоптозных клеток могут быть использованы биохимические маркеры.

Исследования позволили выявить механизмы, лежащие в основе блокирования апоптоза ингибиторами каспаз и защиты ЦНС от повреждений. Ключевые гены, контролирующие гибель клетки, - это гены протеаз CED-3/ICE (семейство каспаз), которые относятся к семейству ингибиторов смерти клеток Bcl-2. Белки, кодируемые генами семейства Bcl-2, делают каспазы неактивными. Аномалии контроля апоптоза вызывают у человека рак и дегенеративные процессы. Показано, что рекомбинантные компоненты апоптозного пути в клетках человека могут быть объединены с целью активации одной из ключевых составляющих, запускающих запрограммированную клеточную гибель. Показано, что гибель клеток в ЦНС опосредуется множеством каспаз, активирующихся при ишемической травме. При этом ингибиторы каспаз снижают повреждение мозга, сопутствующее травме, путём предотвращения гибели нейронов через апоптоз. Противоопухолевый препарат феноксидиол имеет широкий спектр действия на передачу сигнала внутри раковых клеток. При его действии опухолевые клетки не размножаются, и индуцируется их апоптоз. Феноксидиол эффективно тормозит рост некоторых типов опухолевых клеток. Доклинические испытания показали, что он блокирует стимулирующий эффект андрогенов на мезенхимальные клетки предстательной железы и индуцирует их апоптоз. Пути передачи сигнала активируются при связи лиганда с рецептором на поверхности клетки, или при действии на клетку вредных воздействий. Исследование модуляторов передачи сигналов является одним из основных направлений научных разработок. Эти соединения могут играть роль в лечении ряда заболеваний - от рака до воспалительных процессов. Молекулярные пути выживания или гибели клеток регулируются внутриклеточными киназами. Активируясь, эти пути могут запускать процессы фосфорилирования киназ, контролирующих пути выживания клетки. При нейродегенеративных заболеваниях гиперактивация индуцирующих гибель путей может доминировать и даже подавлять механизмы выживания нейрона, что ведёт к гибели клетки. Вследствие этого киназы, являющиеся составными частями процесса передачи сигнала, который опосредует выживание клетки или её гибель, - новые цели для терапевтических вмешательств.

Таким образом, исследования механизмов апоптоза позволяют идентифицировать типы гибели клеток в условиях эксперимента и клиники. Перспективы клинического применения знаний об апоптозе - блокирование элиминации здоровых клеток. Терапевтическое применение могут найти нейтрализующие моноклональные антитела и ингибиторы Fas-зависимого апоптоза. Перспективным направлением является противоопухолевая терапия.

Во время нормального развития организма апоптоз возникает в клетках при формировании формы или структуры органа. Например при образовании конечности мыши некоторые клетки подвергаются апоптозу и образуются пальцы.

Апоптоз во время нормального развития конечности мыши. Клетки подвергшиеся апоптозу (слева) мечены желтым. Та же конечность (справа) через один день. [Alberts]

Интересно, что некоторые птицы, такие как утка, имеют перепонки между пальцами, тогда как у других птиц, таких как курица, перепонок нет. В раннем эмбриогенезе и курицы и утки имеют перепонки между пальцами. Специфический белок BMP4 образуется в клетках между пальцами, запуская клеточную смерть этих клеток. Другой белок BMP (gremlin) образуется вокруг пальцев у обоих птиц и только у уток образуется также и в клетках перепонок, предотвращая запуск апоптоза в них.

Если добавлять белок gremlin в перепонку эмбрионов курицы, то она не подвергается апоптозу и сохраняется.

Слева лапка курицы после добавления в перепонку белка Gremlin (перепонка сохранилась), справа контрольный эксперимент без добавления белка (перепонка подверглась апоптозу).

Другим примером апоптоза в нормальном развитии является метаморфоз головастика лягушки. Под воздействием тиреоидного гормона при метаморфозе головастика лягушки, запускается апоптоз и хвост головастика исчезает. [Alberts, 4th edition]

Пути апоптоза в клетке

Существуют два основных пути апоптоза в клетке:митохондриальный путь и путь через рецепторы апоптоза (смерти).
1. Рецепторы апоптоза - семейства белков CD95 (Apo-1 или Fas) и TNF-R (фактор опухолевого некроза). TNF-альфа высоко цитотоксичная молекула, использовалась как лекарство против рака. TNF-R1 рецептор широко распространен и поэтому не может быть избирательным. Другие представители этого семейства (не все) имеют домен клеточной смерти (DD) - домен белок-белкового взаимодействия связывающийся с белком адаптором, таким как FADD. Активация рецепторов апоптоза лигандами (например, CD-95L и TNF-альфа приводит к активации каспазы-8, запуская каскад реакций ведущих к апоптозу.
2. Митохондриальный путь. Митохондрии выполняют центральную роль в апоптозе, при этом наблюдается увеличение проницаемости митохондриальной мембраны. Баланс между про- и анти-апоптозных членов семейства Bcl-2 регулирует выход про-апоптозных веществ из митохондрий, ведущих к запуску апоптоза, таких как AIF, эндонуклеаза G, Smac/DIABLO и цитохром C. Утечка цитохрома-С из митохондрии приводит к образованию апоптосомы в цитоплазме, которая активирует каспазу-9 и запускает клеточную смерть.
Оба пути приводят к активации каспаз и запуску каскада реакций приводящих к гибели клетки.

Каспазы

Каспазы (caspase) - ферменты расщепляющие белки по остаткам аспартата. Они содержат цистеиновые остатки на своих активных центрах. Многие изоформы каспаз ведут к апоптозу. Они могут быть активированы двумя путями: через рецепторы апоптоза и митохондрии.
Первая открытая каспаза - Ced-3 (Cell Death-3), обнаруженная у нематоды C. elegans. Мутация Ced-3 предотвращала гибель 131 клетки в процессе нормального развития нематоды. Гомолог Ced-3 у млекопитающих - интерлейкин-1альфа-преобразующий фермент (ICE) и был позже назван ингибитор каспазы-1.

Известно 14 каспаз, которые подразделяются на инициаторы, эффекторы и стимуляторы. Инициаторы (каспаза-8 и -9) расщепляют и активируют каспазы эффекторы (каспаза-3). Эффекторы расщепляют различные белки, что ведет к гибели клетки. Активация каспаз ведет к запуску протеолитического каскада реакций ведущих к гибели клетки. При этом одни каспазы активируют другие - амплификация сигнала.

Каспаза представляет собой тетрамер, состоящий из двух больших (~20kDa) и двух малых субъединиц (~10kDa). Большая и малая субъединицы образуется в результате расщепления прокаспазы. Каспаза содержат два активных центра QACXG. Ингибирующий домен (DED или CARD) может быть вырезан из каспазы.
Эффекторные каспазы активируются другими каспазами (трансактивация). Инициаторные каспазы активируются автоактивацией, которая происходит при взаимодействии нескольких прокаспаз (например, прокаспаза-8 и DISC). Рецептор апоптоза сам по себе не обладает протеазной активностью.
Активация каспаз ведет к различным последствиям:
каспаза-9 разрушает ядерные поры, что ведет к проникновению в ядро каспаз-3 и -7. Каспаза-3 расщепляет ингибирующую субъединицу ICAD в двух местах. Выпуск CAD приводит к расщеплению ДНК между нуклеосомами.
Каспазы ведут к реорганизации цитоскелета и распаду клетки на апаптозные тельца.

Каспазы - семейство цистеиновых протеиназ, главные эффекторы апоптоза, существуют в клетке как неактивные проформы и зимогены, которые расщепляются на активные формы ферментов, активируя апоптоз.
Лиганд-->рецептор смерти-->активация инициаторов каспаз (каспаза-8, -10)-->каскад активации других каспаз>активация каспаз-3, -6-->инактивация клеточных структур.
Разрушение клеточных структур при апоптозе
Фрагментация хромосомной ДНК неактивный фермент CAD в комплексе с ICAD (ингибитор CAD-фактор фрагментации ДНК) расщепляется каспазой-3 высвобождая CAD, кот разрезает ДНК м-у нуклеосомами
Инактивация ферментов вовлеченных в репарацию ДНК - фермент поли (ADF-ribose) полимераза, или PARP- первый белок обнаруженный как субстрат для каспаз. PARP вовлекается в репарацию ДНК и катализирует синтез (ADF-ribose) и закрепляет на цепи ДНК ломая и изменяя ядерные белки. Способность PARP репарировать разрушения ДНК предотвращается последующим расщеплением PARP каспазой-3
Инактивация белков вовлеченных в репликацию. Каспазы могут инактивировать ДНК топоизомеразу II, способствуя разрушению ДНК.
Разрушение структурных ядерных белков. Каспаза-6 разрушает ламины разрушая ядро, что приводит к конденсации хромосом.
Чувствительность клеток к стимулам изменяется в зависимости от экспрессии про- и анти-апоптозных белков (Bcl-2 белок ингибитора), серьезности стумулов и стадии клеточного цикла
Распад клетки на везикулы, переход фосфатидилсерина из внутреннего монослоя цитоплазматической мембраны в наружный монослой, уменьшение объема клетки, сморщивание цитоплазматической мембраны, конденсация ядра (апоптозные тельца), фагоцитирующиеся макрофагами и клетками-соседями.
Инициаторы апоптоза
внешние сигналы (связывание лиганда индуцирующего смерть рецептором на клеточной пов-ти), быстрый вариант а
гранзим B может доставляться в клетки цитотоксичными T лимфоцитами, когда они узнают инфицированную клетку, активирует каспазы-3, 7, 8 и 10.

клеточный стресс – радиация, химикалии, вирусная инфекции, недостаток фактора роста, ox стресс | кол-во bcl-2 белков определяет кол-во стресса необходимого для запуска а. Если митохондрии не справляются с удалением активных форм O2, последнии инициируют открытие пор во внеш. м-не и выход в цитозоль белка, ответственного за каскад реакций, ведущих к синтезу протеаз, нуклеаз
Митохондрия может быть ключевым регулятором каспазного каскада и апоптоза - избавление от цитохрома С в митохондрии может вести к активации каспазы 9 и затем каспазы 3. Этот эффект достигается через образование апоптосомы – мультипротеинового комплекса включающего цитохром C, Apaf-1, прокаспазу 9 и АТФ

Апоптосома

Цитохром C освобождается из митохондрий, связываясь с цитозольным белком Apaf-1. Это взаимодействие изменяет конформацию Apaf-1 которая стабилизируется связыванием ATP позволяя молекулам Apaf-1 ассоциировать друг с другом в колесоподобный комплекс состоящий из 7 молекул. Apaf-1, цитохром C и ATP - апоптосома, присоединяющая 7 молекул прокаспаз-9. Возможные механизмы:
1. Apaf-1, цитохром C и прокаспаза-9 – комплекс может активировать цитозольную прокаспазу-9 входящую в апоптосому.
2. Две апоптосомы взаимодействуют друг с другом активируя прокаспазу-9.

Оксид азота NO ингибирует апоптоз в лейкоцитах, гепатоцитах, трофобластах и эндотелиальных клетках. Эффект может быть вызван через нитрозилирование и инактивацию каспаз-3, -1, -8. NO взаимодействует с гемом гуанилат циклазы-->синтез сGMP-->активация cGMP-зависимой протеинкиназы-->экспрессия противоапоптозных белков.
bcl-2 - семейство белков

bcl-2 - семейство белков регуляторы апоптоза (bc-2, bcl-XL – противоапоптозные), (Bad, Bax – проапоптозные) | чувствительность клеток к апоптозным стимулам может зависеть от баланса противо- и проапоптозных bc-2 белков | стресс?проапоптозные bc-2 белки перемещаются на пов-ть митох, инактивируя антиапоптозные белки, что приводит к образ пор в митох и выпуск цитохрома с и др про-апоптозных молекул из межм-ного пр-ва-->формируется апоптосома-->активация каспазового каскада.
Проапоптозные члены Bcl-2 увеличивают проницаемость митохондриальной мембраны, что ведет к попаданию проапоптозных белков в цитоплазму. Противоапоптозные представители семейства - уменьшают проницаемость.
Bcl-2 разделяется на три субсемейства.
Bcl-2 субсемейство включает Bcl-2, Bcl-xL и Bcl-w, являющиеся противоапоптозными.
Bax субсемейство включает Bax, Bak и BAD, являющиеся проапоптозными белками. Их последовательности гомологичны регионам Bcl-2 субсемейства - BH1, BH2 и BH3, но не региону BH4.
BH3 субсемейство с единственным представителем - Bid, у которого гомологичен только BH3 регион.У Bid так же отсутствует трансмембранный домен.
Имеется несколько моделей, как Bcl-2 могут регулировать проницаемость митохондриальной мембраны.
Члены Bcl-2 семейства способны формировать гомо- и гетеродимеры. Гетеродимеризация между про- и противо-апоптозными представителями Bcl-2 ингибирует про-апоптозный белок.
Bcl-2 белки так же способны образовывать ионные каналы (Bcl-xL, Bcl-2 и Bax).
По другому механизму Bcl-2 образуют поры в митохондриальной мембране, осуществляющие неспецифический транспорт небольших молекул меньше 1.5kDa, что нарушает синтез ATP и ведеит к клеточной смерти. Так же цитохром-С и AIF могут выходить в цитоплазму и образовывать апоптосомуt. Bax и Bak - индуцируют выход цитохрома-С и AIF из митохондрий.

Сокращения.

DD - death domain
Caspases - (cysteinyl aspartate-specific proteases)
ICE - interleicin converting enzime

Читайте также: