Онкогены и их функциональная классификация

Обновлено: 17.06.2024

На основании геномных данных 10000 пациентов исследователи из лаборатории разработки инновационных лекарственных средств и агробиотехнологий Физтех-школы биологической и медицинской физики МФТИ подсчитали количество онкогенных мутаций различных молекулярных и функциональных типов в разных видах рака, у пациентов различных демографических и клинических групп. Главной целью классификации было разделение мутаций на значимые и незначимые, чтобы в дальнейшем упростить подбор необходимой терапии. Результаты исследования опубликованы в журнале PLOS Genetics.

«Смертность от рака составляет примерно половину случаев общей смертности, а мутации и различные хромосомные дефекты считаются главной причиной и одновременно механизмом развития рака. Мы анализируем их, чтобы выявлять мишени для потенциальных терапевтических воздействий, чтобы знать, на какие гены, на какие белки воздействовать», — рассказывает Алексей Беликов, один из авторов исследования, старший научный сотрудник лаборатории разработки инновационных лекарственных средств и агробиотехнологий МФТИ. Для классификации мутаций, в том числе на значимые и незначимые, ученые разработали четыре собственных биоинформатических алгоритма, с помощью которых обработали геномные данные из самой крупной базы данных пациентов с онкологией – TCGA PanCanAtlas.

«Один из четырех алгоритмов, которые мы создали, выявляет онкогенные хромосомные дефекты, возникающие в опухолях. До сих пор в мире существовала только одна подобная программа – у американцев, — объясняет Алексей Беликов. — В результате оказалось, что наш алгоритм выявляет дефекты, которые по какой-то причине не выявляла уже существующая программа. Причем эти дефекты подтверждаются другими научными исследованиями».

Среди большого количества мутаций и различных хромосомных аномалий новые алгоритмы позволили выявлять те, которые являются значимыми для развития раковой опухоли. В частности, было выявлено, что в некоторых видах рака на развитие опухоли влияет только одна онкогенная мутация, а в некоторых – два десятка.

«Если взять образец опухоли конкретного пациента и отсеквенировать его, анализ может показать сотни мутаций, и для лечения придется подобрать ингибиторы сотни белков, что не представляется возможным, — говорит Алексей Беликов. — Наш анализ показывает, что в среднем значимыми оказываются 12 мутаций на опухоль, и это позволяет в дальнейшем воздействовать именно на нужные белки, а не действовать вслепую».

Исследование позволило с высокой точностью определить количество различных типов онкогенных мутаций. Были проведены классификации по полу и возрасту пациентов, типу и стадии рака, а также по другим критериям.

Рисунок. Распределение онкогенных мутаций по типам рака*. Источник: PLOS Genetics

Рисунок. Распределение онкогенных мутаций по возрасту. Источник: PLOS Genetics

Ученые выдвигают гипотезы относительно некоторых из этих вопросов в своем исследовании; другие же, такие как причина высокой вариативности количества и состава онкогенных мутаций между типами рака, пока остаются без ответа. «В целом, наша работа вносит определенную ясность в распределение онкогенных мутаций различных классов в различных демографических и клинических группах пациентов», — резюмирует Алексей Беликов.

«Наше исследование имеет большое значение для развития персонализированной онкологии. В продолжение этой работы мы уже разработали новый биоинформатический подход к определению онкогенной силы мутаций в ключевых генах. Доказав значимость мутаций этих генов для злокачественного перерождения нормальных клеток in vitro и in vivo, мы сможем пролить свет на молекулярные механизмы возникновения и развития рака, что в перспективе позволит осуществить оптимальный выбор мишеней для персонализированной терапии каждого онкологического пациента», — поясняет Сергей Леонов, заведующий лабораторией разработки инновационных лекарственных средств и агробиотехнологий МФТИ.

Онкогены и их функциональная классификация

Рост и развитие. Деление клеток

А. Протоонкогены: биологическая роль

Онкогенами называют гены, вызывающие развитие опухолей. Вирусные онкогены сначала были обнаружены у онкогенных вирусов. Клеточные онкогены, так называемые протоонкогены, являются почти точными копиями (гомологами) вирусных онкогенов. Кодируемые такими генами белки принимают участие в регуляции процессов роста и дифференцировки, в особенности клеточной пролиферации (см. рис. 381). В свою очередь контроль за функционированием этих генов осуществляется генами-онкосупрессорами (антионкогенами).

Протоонкогены приобретают свойства онкогенов за счет мутации, делении, суперэкспрессии, т. е. они могут вызывать развитие опухоли, если одновременно нарушена регуляция со стороны генов-супрессоров.

Б. Продукты онкогенов: биохимические функции

Общим признаком всех онкогенов является кодирование белков, принимающих участие в передаче сигнала.

1. Лиганды , кодируемые протоонкогенами, обнаруживаются как внеклеточные продукты. Они гомологичны ростовым факторам.

2. Кодируемые протоонкогенами мембранные рецепторы подобны рецепторам первого типа, которые имеют один трансмембранный домен, обладающий тирозинкиназной активностью и способный связывать гормоны и ростовые факторы (см. рис. 373).

3. В нормальных клетках ГТФ-связывающие белки присутствуют как в плазматической мембране, так и в цитоплазме. Мембранные G-белки передают сигнал от рецепторов третьего типа, имеющих семь трансмембранных тяжей (см. рис. 373), на эффекторные системы плазматической мембраны. Внутриклеточные G-белки принимают участие в регуляции синтеза и транспорта белков. G-белки медленно гидролизуют ГТФ (GTP) до ГДФ и переходят в неактивное состояние. Белки, кодируемые протоонкогеном ras и рядом других онкогенов, родственны ГТФ-связывающим белкам.

4. Ядерные рецепторы гормонов передают сигнал о г липофильных сигнальных веществ путем регуляции транскрипции определенных генов (см. рис. 367). Некоторые протоонкогены принадлежат к этому семейству лиганд-активируемых факторов транскрипции.

5. Ядерные онкосупрессоры блокируют вступление дифференцированных клеток в митотический цикл. Кодирующие их гены также могут быть отнесены к антионкогенам.

6. ДНК-связывающие белки хроматина обладают разнообразными функциями. Некоторые онкогены обнаруживают сходство с факторами транскрипции.

7. Протеинкиназы играют центральную роль в механизме внутриклеточной передачи сигнала. Эти ферменты катализируют фосфорилирование белков, модулируя их биологическую активность, которая возвращается к норме лишь после действия протеинфосфатаз. Конверсия белков путем фосфорилирования (протеинкиназами) и дефосфорилирования (протеинфосфатазами) (см. рис. 117) считается основным механизмом регуляции многих внутриклеточных процессов. К семейству протеинкиназ принадлежат многие белки, кодируемые протоонкогенами.

Большое семейство протеинкиназ подразделяется на группы как по механизму активации, так и по типу субстрата. Протеинкиназы А активируются цАМФ, протеинкиназы G — цГМФ, протеинкиназы С — диацилглицерином (ДАГ), Са 2+ /кальмодулин-зависимые киназы — ионами кальция (см. рис. 375). Классификация по типу субстрата зависит от того, какая аминокислота фосфорилируется данным ферментом. Известны тирозинкиназы и серин/треонинкиназы. При этом киназы могут иметь широкий спектр специфичности по субстрату или фосфорилировать только немногие белки. Многие протеинкиназы являются растворимыми белками, другие относятся к мембранным белкам, имеющим трансмембранные домены или заякоренным на мембране с помощью жирных кислот.

Классифицированы данные из крупнейшей базы онкогенных мутаций

На основании геномных данных 10000 пациентов исследователи из лаборатории разработки инновационных лекарственных средств и агробиотехнологий Физтех-школы биологической и медицинской физики МФТИ подсчитали количество онкогенных мутаций различных молекулярных и функциональных типов в разных видах рака, у пациентов разных демографических и клинических групп. Главной целью классификации было разделение мутаций на значимые и незначимые, чтобы в дальнейшем упростить подбор необходимой терапии.

Раковая клетка под микроскопом / ©Getty images

Результаты исследования опубликованы в журнале PLOS Genetics. «Смертность от рака составляет примерно половину случаев общей смертности, а мутации и различные хромосомные дефекты считаются главной причиной и одновременно механизмом развития рака.

Мы анализируем их, чтобы выявлять мишени для потенциальных терапевтических воздействий, чтобы знать, на какие гены, на какие белки воздействовать», — рассказывает Алексей Беликов, один из авторов исследования, старший научный сотрудник лаборатории разработки инновационных лекарственных средств и агробиотехнологий МФТИ.

Для классификации мутаций, в том числе на значимые и незначимые, ученые разработали четыре собственных биоинформатических алгоритма, с помощью которых обработали геномные данные из самой крупной базы данных пациентов с онкологией — TCGA PanCanAtlas.

«Один из четырех алгоритмов, которые мы создали, выявляет онкогенные хромосомные дефекты, возникающие в опухолях. До сих пор в мире существовала только одна подобная программа — у американцев, — объясняет Алексей Беликов. — В результате оказалось, что наш алгоритм выявляет дефекты, которые по какой-то причине не выявляла уже существующая программа. Причем эти дефекты подтверждаются другими научными исследованиями».

Почему у одних видов рака нет изменений в онкогенах, а у других нет изменений в опухолевых супрессорах? Объясняются ли эти различия разным тканевым микроокружением, к которому эти опухоли должны приспосабливаться? Почему тогда для некоторых пациентов с одним и тем же типом рака достаточно одной онкогенной мутации для развития обнаруживаемой опухоли, тогда как у других опухоли не диагностируются, пока не будут накоплены десятки мутаций? На все эти вопросы еще предстоит ответить.

Генетические основы гемобластозов

Изучение патогенеза опухолевых заболеваний системы крови привело к открытию одного из ведущих принципов онкогенеза в целом: причиной формирования злокачественного клона является нарушение функционирования нормальных генов. Как правило, это происходит в результате хромосомных аберраций, мутаций отдельных генов или блокирования нормальной регуляции функционирования генов в связи с эпигеномными (не связанными непосредственно с повреждением структуры генов) событиями.

Молекулярная генетика гемобластозов как отдельное научное направление стала развиваться в связи с успехами цитогенетики, которая, начавшись как дисциплина описательная, в дальнейшем позволила успешно идентифицировать гены, участвующие в хромосомных нарушениях.

В последние годы во всем мире продолжается активная исследовательская работа по идентификации генетических аномалий при гемобластозах и изучению их влияния на процессы жизнедеятельности клетки. Известно большое количество генетических нарушений, ведущих к развитию определенных видов опухолевых заболеваний крови. Детекция аномальных генов в настоящее время является обязательным условием для установления диагноза целого ряда гемобластозов.

Более того, выявление определенных транслокаций и мутаций позволяет достаточно уверенно предполагать особенности течения заболевания, судить в ряде случаев о прогнозе и подбирать адекватную терапию. Особое значение приобрело развитие основанной на полученных знаниях так называемой «прицельной терапии», позволяющее проводить коррекцию имеющихся нарушений на генетическом или биохимическом уровне.

Самыми яркими примерами лекарственных препаратов, применяемых как «прицельная терапия», являются полностью трансретиноевая кислота (АТРА) и иматиниба мезилат (Гливек), позволившие внести революционные изменения в терапию острого промиелоцитарного лейкоза (ОПЛ) и хронического миелолейкоза (ХМЛ).

Популярное ранее представление, что участие генов в транслокациях, нарушающих структуру их ДНК, само по себе придает им способность трансформировать клетку, сейчас кажется несколько упрощенным. Традиционно гены, участвующие в канцерогенезе классифицировались в одну из двух категорий: протоонкогены или опухолевые супрессоры. В настоящее время выделена третья категория: гены, поддерживающие целостность ДНК или обеспечивающие реконструкцию ДНК вследствие повреждений. Участвуя в аберрациях, эти гены не обладают способностью к трансформации, однако способствую накоплению трансформирующих мутаций.

Таким образом, эти три категории генов при любом виде повреждения прямым или непрямым способом ведут к малигнизации клетки.

Онкогены: исторически, гены, захваченные быстро трансформирующими ретровирусами из генома клетки называюся онкогенами, а их клеточные гомологи – протоонкогенами. В более широком смысле, онкогенами называются любые гены, образование доминантных мутаций в которых ведет к малигнизации клетки.

В настоящее время известно боле 30 ретровирусных онкогенов, имеющих клеточные аналоги. Лишь небольшая часть из них участвует в транслокациях, приводящих к развитию гемобластозов, но практически все задействованы в основных регуляторных путях. Гены, вовлеченные в транслокации, могут вызывать трансформацию клетки с помощью двух механизмов. Классическим примером первого из них является транслокация t(9;22), когда происходит формирование химерного онкогена bcr/abl, белок которого – тирозинкиназа – обладает непосредственным трансформирующим потенциалом.

Подобное происходит а транслокациях, вовлекающих гены MLL, RUNX1, RAR. Второй механизм активации часто встречается при лимфоидных опухолях, когда транслокация затрагивает гены тяжелых цепей иммуноглобулинов или Т-клеточных рецепторов. При этом второй ген-участник транслокации, в норме «молчащий» на этой фазе клеточной дифференцировки, начинает усиленно экспрессироваться. Это обычно приводит к остановке дифференцировки клетки на определенной стадии и усиленной пролиферации.

Гены-супрессоры опухоли: Обнаружение хромосомных делеций, часто возникающих при определенных видах опухолей, привело к выявлению генов-супрессоров опухоли, потеря которых вызывает злокачественную трансформацию клетки. Подразумевается, что при потере одного гена одновременно должна происходить механическая или функциональная потеря такого же гена на второй хромосоме, для того, чтобы реализовался негативный эффект мутации.

Этот механизм часто задействован при солидных опухолях (например, RB1 при ретинобластоме, TP53 при опухолях толстого кишечника). Известно около 30 регионов, расположенных на 13 хромосомах, в которых регулярно происходят делеции или обнаруживается потеря гетерозиготности, ведущие к развитию онкогематологических заболеваний.

Как ни странно, лишь в некоторых из них обнаруживаются гены, претендующие на название опухолевых супрессоров. В настоящее время рассматривается гипотеза, что в ряде случаев бывает достаточно мутации лишь одной аллели гена-супрессора для реализации трансформирующего эффекта. Предположительно, значение имеет так называемая «доза» гена.

Гены, поддерживающие целостность ДНК. Мутации в этих генах не приводят непосредственно к развитию опухолей, однако, в результате возрастания генетической нестабильности, способствуют накоплению мутаций в клетке. Зачастую эти гены, относящиеся к микросателлитам (например, MLH1 и MSH2) мутируют в случаях солидных опухолей. Для гемобластозов такие виды мутаций нехарактерны.

Отражением другого вида генетической нестабильности являются множественные хромосомные аберрации у пациентов ОМЛ и МДС из группы высокого риска. Как правило, течение таких видов лейкемии сопровождается быстрым развитием резистентности к терапии или возникновением ранних рецидивов. Очевидно, наличие множественных хромосомных аберраций является отражением ранних событий в лейкемической клетке, скорее всего, повреждением механизма восстановления двухцепочечной ДНК. Известен ряд генов, которые, возможно, вовлечены в этот процесс (ATM, TP53, MRE11).

Генетические аномалии при острых миелоидных лейкозах

Основными молекулярными событиями, ведущими к формированию лейкемического клона при миелоидных лейкозах, являются либо возникновение специфических транслокаций, зачастую с вовлечением протоокогенов, либо мутации генов, участвующих в контроле пролиферации и дифференцировки миелоидной ткани. Для миелоидных опухолей наиболее характерными являются реципрокные транслокации, при которых происходит обмен генетическим материалом между различными хромосомами с образованием патологических хромосомных структур, самой известной из которых является Филадельфийская хромосома.

На молекулярном уровне в процессе такой транслокации образуется так называемый химерный ген, состоящий из активных участков (доменов) двух генов-участников перестройки и ведущий к экспрессии химерного белка, который способен, как правило, либо блокировать миелоидную дифференцировку, либо стимулировать бесконтрольную клеточную пролиферации за счет следующих событий:

нарушение функционирования ядерных рецепторов (характерный пример – острый промиелоцитарный лейкоз);
подавление транскрипции (считывания РНК с ДНК) за счет связывания ключевого белкового комплекса CBF (core binding factor), что характерно для острых лейкозов с транслокациями, вовлекающими 21 и 16 хромосомы (гены RUNX-1, бывший AML-1, и CBFB);
подавление генов гомеобокса, или регуляторов клеточного развития (характерно для ОМЛ с транслокациями, в которых участвует ген MLL – mixed lineage leukemia-, расположенный на 11 хромосоме);
бесконтрольная активация ферментов-тирозинкиназ (BCR-ABL позитивные миелоидные лейкозы, мутации гена FLT3);

Особо хотелось бы отметить важность мутаций генов, не вовлеченных в транслокации, но являющихся медиаторами процессов, описанных выше. К ним относятся частичная тандемная дупликация гена MLL в случае соматической мутации 11q23, внутренняя тандемная дупликация гена FLT3, ведущая к активации киназного каскада за счет маскировки под нормальный киназный рецептор, мутации генов СЕВРА и RUNX1 (AML1), подавляющих транскрипцию за счет связывания комплекса CBF, мутации гена NPМ, приводящие к блоку образования белков в рибосомах.

Значение химерного гена PML/RARA при остром промиелоцитарном лейкозе и его роль в блоке миелоидной дифференцировки

На рис. 3 изображена нормальная регуляция миелоидной дифференцировки в результате активации рецептора ретиноевой кислоты α (RARα). В неактивном виде рецептор образует подавляющий транскрипцию комплекс вместе с другим рецептором этого же семейства (RXR), ядерными помощниками – корепрессорами (SMRT, N-CoR, Sin3a) и белком гистондеацетилазой HDAC.

Этот комплекс соединяется со специфическим участком ДНК (RARE – retinoid acid responsive element), полностью блокируя считывание РНК. В нормальной ситуации рецептор связывается с ретиноевой кислотой (RA) и связь с корепрессорами разрушается. Далее, вместо корепрессоров, происходит присоединение коактиваторов (P300, CBP), что приводит к активации нормальной миелоидной дифференцировки.

При образовании транслокации t(15;17), ведущей к появлению химерного белка PML/RARA, возникает прочная связь рецептора с корепрессорами, не разрушающаяся в присутствии физиологических концентраций полностью транс-ретиноевой кислоты (ATRA). ДНК освобождается лишь в присутствии фармакологических концентраций ATRA, превышающих физиологическую в тысячи раз. Только это делает возможной нормальное функционирование белкового комплекса и дальнейшую миелоидную дифференцировку (10).

Тот же механизм работает и при транслокации t(5;17), вовлекающей гены NPM и RARA. Совершенно другая ситуация возникает при ОПЛ с транслокацией t(11;17) (PLZF/RARA) и t(11;17) STAT5b/RARA. Ген PLZF, так же как и STAT5b, имеет собственные зоны контакта с комплексом корепрессоров и добавление ретиноевой кислоты не приводит к освобождению зависимых генов для нормальной экспрессии. Сложность диагностики при остром промиелоцитарном лейкозе заключается в том, что морфологические и цитохимические методы не позволяют различать между собой разные виды характерных транслокаций.

Стандартная цитогенетика зачастую неэффективна, так как при ОПЛ клетки костного мозга в обычной краткосрочной культуре делятся плохо, и материала не хватает для подтверждения диагноза ОПЛ и дифференцирования транслокаций. Все вышеуказанные транслокации возможно определять с помощью флюоресцентной in situ гибридизации (FISH) или метода обратной транскриптазной реакции с проведением далее так называемой гнездной полимеразной цепной реакции.

Рис. 3. Нормальная регуляция миелоидной дифференцировки путем активации рецептора ретиноевой кислоты.

Таким образом, определение транслокаций при ОПЛ является крайне необходимым не только для установления правильного диагноза, но и для определения первичной резистентности к стандартной для ОПЛ терапии ATRA и, соответственно, к определению прогноза (благоприятного при t(15;17) и t(5;17) и неблагоприятного при всех остальных видах транслокаций).

Значение определения транслокаций, участвущих в репрессии комплекса CBF

Образование нормального комплекса CBF, ведущего к активации гена макрофагального колониестимулирующего фактора (M-CSF), играет важнейшую роль в миелоидной дифференцировке и напрямую зависит от формирования связи между белками-продуктами генов c/EBPα, AML1(RUNX1) и CBFβ (рис 4). Поэтому, все транслокации, вовлекающие хотя бы один из перечисленных генов, такие как t(8;21) или inv 16 превращают указанный комплекс из активатора в репрессор, и таким образом блокируют миелоидную дифференцировку.

Блокада происходит с участием ядерных корепрессоров и гистондеацетилаз, тех же что были описаны в предыдущем разделе, касающемся лейкемогенеза при ОПЛ. Надо отметить, что любые мутации генов, участников комплекса CBF, таких как c/EBPα, RUNX1, даже при отсутствии цитогенетически определяемых нарушений ведут к формированию лейкемического фенотипа, то есть, нарушению дифференцировки и бесконтрольной пролиферации. Тем не менее, по современной классификации, обнаружение данных нарушений относят этот тип лейкоза в благоприятную группу (при условии проведения соответствующей терапии).

Рис. 4. Образование комплекса CBF

Обычно транслокации t(8;21) или inv 16 и др. довольно легко определяются при стандартном цитогенетическом исследовании. Так же, как и при ОПЛ, используется обратно-транскриптазная полимеразная цепная реакция. При определении мутаций генов c/EBPα, RUNX1 с наибольшей эффективностью может быть применена только ПЦР.

Если учесть, что данные аберрации суммарно встречаются примерно в 15-20% М2 без цитогенетически выявляемых нарушений, становится ясной необходимость выявления этих мутаций, тем более, что по последним данным, обнаружение таких аномалий без сочетания с другими цитогенетическими нарушениями относит этот тип лейкоза из группы промежуточного в группу благоприятного прогноза.

Определение транслокаций, ведущих к активации тирозинкиназ и киназных рецепторов.

Самой известной транслокацией, приводящей к аномальной активации киназного каскада и неконтролируемой клеточной пролиферации, является Филадельфийская хромосома или t(9;22), ведущая к образованию химерного гена BCR/ABL (рис 5). В зависимости от локализации точки разрыва на 22 хромосоме образуется химерный онкоген различной длины (от 190 до 230 килодальтон).

Продукт этого гена (тирозинкиназа) ведет к фосфорилированию огромного количества протеинов (RAS, PI-3, Grb2, Crkl), участвующих в процессе сигнальной трансдукции – передаче сигнала с рецепторов клеточной мембраны ядерному генетическому материалу. Активация такого количества различных сигнальных путей ведет к независимой от ростовых факторов пролиферации, нарушению адгезии клеток к стромальному окружению и устойчивости к апоптозу – программированной клеточной гибели. При остром миелоидном лейкозе встречается как тип транслокации с точкой разрыва M-bcr, ведущий к образованию протеина размером 210 килодальтон (р210), так и m-bcr, с образованием протеина p190.

Рис. 5. Образование химерного гена BCR/ABL.

Другим вариантом самопроизвольной стимуляции киназного каскада является выявление мутации гена FLT3 (FMS-like tyrosine kinase receptor), кодирующего тирозин-киназный рецептор. Образование так называемой внутренней тандемной дупликации в структуре гена ведет к изменению третичной структуры рецептора таким образом, что он мимикрирует под обычный рецептор, уже активированный специфическим лигандом.

Это ведет к активации протеинкиназ ERK2 и AKT, приводит к неконтролируемой пролиферации и обычно ассоциируется с выраженным лейкоцитозом. Следует особо отметить, что выявление этого нарушения у пациентов с t(15;17) или у больных без явных нарушений кариотипа резко ухудшает прогноз и переводит этих пациентов в группу неблагоприятного течения ОМЛ.

По данным последних исследований, все виды нарушений, связанных с активацией киназных сигнальных путей являются независимым отрицательным прогностическим признаком.

Значение выявления транслокаций, ведущих к нарушению экспрессии генов гомеобокса

К генам гомеобокса относят целый ряд генов, кодирующих транскрипционные факторы, которые принимают участие в регуляции эмбрионального развития. Эти гены имеют высоко гомологичную структуру у большинства эукариот, от самых низших до наиболее высоко организованных. Наиболее значимым геном-регулятором экспрессии генов гомеобокса у млекопитающих является ген MLL (mixed lineage leukemia).

Партнерами этого гена являются гены-регуляторы транскрипции, поэтому любые мутации, вовлекающие MLL, ведут к подавлению транскрипции генов гомеобокса. Точный механизм лейкемогенеза в данном случае пока до конца не определен. MLL участвует в образовании более 25 различных транслокаций, которые (кроме t(4;11)) обычно характерны для ОМЛ М4/М5. Наиболее известным и распространенным нарушением является соматическая мутация 11q23, приводящая к образованию частичной внутренней тандемной дупликации, в которой участвуют экзоны со 2 по 6 или со 2 по 8. Подобное нарушение определяется в случаях трисомии 11 хромосомы и в 11-20% случаев ОМЛ без цитогенетических нарушений. Следует отметить, что любое нарушение структуры гена MLL однозначно определяет неблагоприятный вариант течения ОМЛ.

Мутации гена NPM

Ген нуклеофозмина (NPM-1) в последнее время привлекает все более пристальное внимание исследователей, ввиду частой выявляемости мутаций этого гена при ОМЛ с нормальным кариотипом (50%-60%). В норме продукт этого гена играет ключевую роль в образовании протеосом и, таким образом, опосредованно влияет на синтез белков в клетке. Ген NPM-1 участвует в ряде реципрокных транслокаций, характерных для анаплазированной Т-клеточной лимфомы t(2;5), редко встречающихся форм МДС с транслокацией t(3;5), и крайне редкого типа ОПЛ с t(5;17).

Для ОМЛ более характерны мутации NPM-1, наиболее частой из которых является дупликация тетрануклеотида TCTG в позиции 956-959 в 5 экзоне (75-80% случаев). Во всех случаях мутаций или транслокаций с участием NPM-1 происходит изменение нормального внутриядерного расположения белка на цитоплазматическое и нарушается его взаимодействие с генами – партнерами (ТР53 и ARF), что инактивирует их как опухолевые супрессоры. Тем не менее, обнаружение мутаций NPM-1, как правило, ассоциируется с благоприятным течением ОМЛ (за исключением случаев ассоциации с мутациями гена FLT-3). В настоящее время продолжается активное изучение этого гена с целью уточнения его роли в лейкемогенезе и возможного использования его как маркера при исследовании минимальной остаточной болезни.

Генетические маркеры

Все изменения последовательности нуклеотидов в ДНК, независимо от локализации и влияния на жизнеспособность клетки, – мутации. Нейтральные мутации или полиморфизмы – последовательности ДНК, не приводящие к заметным нарушениям функций.

Существуют две классификации мутаций (Strachan T., Read A., 2003). Одна базируется на функциональной характеристике и не рассматривает характер самой мутации. Вторая классифицирует мутации по структурным изменениям в ДНК и РНК.

Функциональная классификация подразделяет мутации:

связанные с потерей функции белка;
связанные с приобретением новой аномальной функции белка;
в регуляторных областях гена, приводящие к количественным изменениям первичного белкового продукта.

Структурная классификация выделяет следующие типы:

нонсенс-мутация – изменение в нуклеотидной последовательности ДНК кодирующей области гена, приводящее к возникновению стоп-кодона и преждевременному прекращению синтеза белка;
миссенс-мутация – изменение в нуклеотидной последовательности ДНК кодирующей области гена, приводящее к изменению одной аминокислоты, что не нарушает процесс синтеза белка;
мутации, приводящие к сдвигу рамки считывания белка и возникновению стоп-кодона на некотором расстоянии от самой мутации, что приводит к преждевременной терминации синтеза белка. Мутации сдвига рамки считывания вызываются делециями и инсерциями, не кратными трем (кодон = 3) нуклеотидам;
мутации в сайтах сплайсинга приводят к тому, что нарушается процессинг мРНК, что ведёт к: а) делеции всего или части экзона; б) обычно удаляемые интронные области могут стать смысловыми. Такая патология приводит к сдвигу рамки считывания и появлению стоп-кодона. В результате белковый продукт гена не только укорачивается, но и может оказаться совершенно аномальным.

Для злокачественных опухолей характерны все типы мутаций. Высокоинформативными структурными ДНК-маркерами, позволяющими проводить раннюю диагностику опухолевого процесса, определять прогноз развития заболевания и подбирать наиболее эффективные варианты терапии, являются характерные нарушения нуклеотидной последовательности белок-кодирующих генов в некоторых типах опухоли.

ДНК-диагностика мутаций может быть косвенной и прямой (Strachan T., Read A., 2003).

При прямой диагностике предметом анализа являются мутации гена. Прямые методы возможны лишь при наличии информации об экзон-интронной организации или полноразмерной нуклеотидной последовательности ДНК гена.

ПЦР с использованием определенного фермента гидролиза ДНК возможна при стандартной мутации с изменением сайта рестрикции, если без изменения сайта рестрикции – аллель-специфическая ПЦР.

Определение нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК, показавшего аномальную электрофоретическую подвижность, и заключительным этапом анализа мутаций является их секвенирование. Прямое секвенирование позволяет с 100% эффективностью определить мутацию.

В косвенной диагностике мутаций используются несколько методов. Наиболее просто при электрофоретическом анализе обнаруживаются мутации, изменяющие длину амплифицированных фрагментов ДНК.

Для выявления точковых мутаций, небольших делеций и инсерций в исследуемых генах используется множество различных подходов, основанных на методе полимеразной цепной реакции. При ПЦР возможно многократно увеличить уникальную последовательность ДНК, а затем проанализировать её на наличие мутации.

Метод конформационного полиморфизма однонитевой ДНК (SSCP) – один из наиболее простых в исполнении высокочувствительных методов поиска однонуклеотидных замен в исследуемом участке геномной ДНК. Оптимальный размер исследуемого фрагмента ДНК 200-250 п.н., при котором вероятность обнаружения мутаций составляет 70-95%.

Вероятность идентификации точковых мутаций методом гетеродуплексов достигает 80-90% при длине фрагментов ДНК не более 300 п.н. Метод основан на том, что за счет конформационных особенностей в местах несовпадения нуклеотидов электрофоретическая подвижность гетеродуплексов, образующихся при комплиментарном взаимодействии мутантной и нормальной ДНК отличается от подвижности гомодуплексов нормальных фрагментов ДНК.

Наиболее распространенным способом скрининга мутаций, позволяющим выявить точковые мутации почти в 100% случаев и не требующим больших затрат времени, считается комбинация анализа гетеродуплексов и метода однонитевого конформационного полиморфизма.

Читайте также: