Цитогенетическое исследование при миелодиспластических синдромах - диагностика аномалий хромосом

Обновлено: 07.05.2024

Миелодиспластический синдром (МДС) представляет собой группу заболеваний, характеризующихся цитопенией в периферической крови, дисплазией гемопоэтических клеток-предшественников, гиперклеточностью или гипоклеточностью костного мозга и высоким риском развития острого миелолейкоза Острый миелолейкоз (ОМЛ) При остром миелолейкозе (ОМЛ) злокачественная трансформация и неконтролируемая пролиферация аномально дифференцированных, долго живущих клеток-предшественниц миелоидного ряда вызывает появление. Прочитайте дополнительные сведения

Ежегодное число людей в Соединенных Штатах с диагнозом миелодиспластический синдром (МДС) неизвестно. Согласно некоторым оценкам, это число составляет около 10 000, в то время как по другим оценкам оно намного выше. МДС чаще всего диагностируется у пациентов в возрасте 70 лет.

Патофизиология МДС

Миелодиспластические синдромы представляют собой группу заболеваний клональных гемопоэтических стволовых клеток, объединенных наличием различных мутаций гематопоэтических стволовых клеток, чаще всего в генах, участвующих в сплайсинге РНК. Миелодиспластические синдромы характеризуются неэффективным и диспластическим гемопоэзом и включают в себя следующее:

Рефрактерная анемия: анемия с ретикулоцитопенией; нормальный или гиперклеточный костный мозг с эритроидной гиперплазией и дизэритропоэзом; содержание бластных клеток составляет ≤ 5% ядросодержащих клеток костного мозга

Рефрактерная анемия с кольцевыми сидеробластами: то же, что и рефрактерная анемия с ретикулоцитопенией, за исключением того, что кольцевые сидеробласты составляют > 15% ядросодержащих клеток костного мозга

Рефрактерная цитопения с мультилинейной дисплазией: цитопения не определяется только эритроцитами;имеет место выраженная дисплазия предшественников лейкоцитов и мегакариоцитов

Рефрактерная цитопения с мультилинейной дисплазией и кольцевыми сидеробластами с наличием кольцевых сидеробластов, которые составляют > 15% ядросодержащих клеток костного мозга

Рефракторная анемия с избытком бластов (РАИБ) (RAEB en.): цитопения ≥ 2 клеточных линий с морфологическими аномалиями гематопоэтических клеток; гиперцеллюлярный костный мозг с дизэритропоэзом и дисгранулопоэзом; разрушает от 5 до 9% (RAEB-I) или от 10 до 19% (RAEB-II) ядросодержащих клеток костного мозга.

Миелодиспластический синдром неклассифицированный: МДС, который не попадает ни в одну из определенных категорий

МДС с изолированной делецией 5q: обычно тяжелая анемия и тромбоцитоз с делецией длинного плеча пятой хромосомы.

Хронический миеломоноцитарный лейкоз (ХММЛ) и ювенильный миеломоноцитарный лейкоз (ЮММЛ): смешанные миелодиспластические/миелопролиферативные новообразования; абсолютный моноцитоз (> 1000/мкл [> 1/л]) крови; значительное увеличение количества предшественников моноцитов в костном мозге

Хронический нейтрофильный лейкоз: характеризуется нейтрофилией, гибридным геном BCR-ABL1 и отсутствием филадельфийской хромосомы.

Этиология миелодиспластического синдрома неизвестна. Риск повышается с возрастом из-за приобретенных соматических мутаций, которые могут способствовть клональной экспансии и доминированию определенных гемопоэтических стволовых клеток, и, возможно, посредством воздействия внешних токсинов, таких как бензин, ионизирующие излучение и химиотерапевтические препараты (особенно продолжительные или интенсивные курсы лечения, а также с использованием алкилирующих агентов, гидроксимочевины или ингибиторов топоизомеразы). Часто присутствуют хромосомные аномалии (например, делеции, дупликации, структурные аномалии).

Костный мозг может быть гиперклеточным или гипоклеточным Неэффективный гемопоэз приводит к анемии (встречается наиболее часто), нейтропении, тромбоцитопении, или к комбинации этих патологий, вплоть до аплазии костного мозга. У пациентов со значительной рефрактерной или хронической анемией в конечном итоге развивается перегрузка железом ввиду переливания крови и/или повышенной абсорбции железа с кишечника.

Нарушение клеточной продукции также сопровождается изменениями морфологии клеток в костном мозге и крови. Иногда развивается экстрамедуллярный гемопоэз, приводящий к гепатомегалии и спленомегалии. Во время МДС может развиваться миелофиброз Первичный Миелофиброз Первичный миелофиброз (ПМФ) – это хроническое миелопролиферативное новообразование, которое характеризуется фиброзом костного мозга, спленомегалией и анемией с наличием ядросодержащих и каплевидных. Прочитайте дополнительные сведения . Классификация основана на данных общего анализа крови и исследований костного мозга, а также учитывается кариотип и мутация. Клон МДС имеет тенденцию к трансформации в острый миелолейкоз Острый миелолейкоз (ОМЛ) При остром миелолейкозе (ОМЛ) злокачественная трансформация и неконтролируемая пролиферация аномально дифференцированных, долго живущих клеток-предшественниц миелоидного ряда вызывает появление. Прочитайте дополнительные сведения

Симптомы и признаки МДС

Симптомы миелодиспластического синдрома зависят от наиболее пораженной клеточной линии и могут включать бледность, слабость и утомляемость (анемия), лихорадку и инфекции (нейтропения), повышенную склонность к кровоизлияниям, петехиям и кровоточивости из слизистых оболочек (тромбоцитопения). Спленомегалия и гепатомегалия не редкость.

Цитогенетическое исследование при миелодиспластических синдромах - диагностика аномалий хромосом

Цитогенетический анализ клеток костного мозга (кариотип) – исследование, целью которого является оценка количества и структуры хромосом клеток кроветворной ткани.

Синонимы русские

Стандартное кариотипирование клеток костного мозга, стандартная цитогенетика в метафазных пластинках.

Синонимы английские

Chromosome Analysis, Bone Marrow, Karyotype, Cytogenetics, Cytogenetic Analysis, Chromosome Studies, Chromosome Karyotype.

Метод исследования

Дифференциальное окрашивание хромосом.

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Общая информация об исследовании

Взятие костного мозга для исследования проводится посредством пункции кости. Манипуляцию выполняет врач. Чаще всего костный мозг аспирируется из грудины или задних остей подвздошных костей. После выбора места пункции и обработки кожи над ним раствором антисептика врач проводит послойную местную анестезию до надкостницы. После введения анестетика ждут наступления анестезии не менее одной минуты. Пункцию выполняют специальной иглой, которая имеет внутри стержень. Её продвигают сквозь мягкие ткани до надкостницы, затем с усилием внедряют вглубь костного вещества. После этого убирают стержень и шприцем набирают костный мозг. Во время аспирации возможно возникновение болевых ощущений из-за перепада давления в полости кости. Полученный костный мозг переливают в вакутейнер, содержащий гепарин натрия, и отправляют в лабораторию.

Большинство опухолей кроветворной системы связаны с возникновением генетических изменений в столовой клетке крови, которые приводят к её злокачественной трансформации и появлению опухолевого клона. Генетические нарушения специфичны для определенного заболевания, поэтому их обнаружение считается достоверным диагностическим критерием. Кроме того, наличие некоторых генетических аномалий может влиять на прогноз заболевания, его чувствительность к тем или иным способам лечения и, соответственно, помогает выбрать наилучшую тактику терапии. Стандартное цитогенетическое исследование клеток костного мозга представляет собой изучение количества и структуры хромосом клеток и позволяет выявить геномные (нарушения в количестве хромосом) и хромосомные (изменения в их структуре) мутации.

Хромосомы – структуры в ядре клетки, в которых компактно собрана генетическая информация в виде ДНК. Когда клетка находится в состоянии покоя, хромомосы упакованы в клеточном ядре и визуально различить их друг от друга невозможно. Однако в одну из фаз деления клетки, которая называется метафаза, хромосомы выстраиваются в одну плоскость в центре клетки, формируя так называемую метафазную пластинку. Именно такие метафазные пластинки и изучаются в процессе цитогенетического исследования. Кроветворные клетки костного мозга постоянно делятся, поэтому часть из них во время взятия как раз будет находиться в метафазе своего деления. Преимущество такого метода цитогенетического исследования в том, что оно не требует дополнительных воздействий на клетки для стимуляции деления и получения метафаз. После обработки биоматериала различными химическими веществами клетки фиксируют на предметных стеклах и производят окраску. Существует несколько методов окраски хромосом, каждый из которых позволяет лучше дифференцировать те или иные особенности их строения. Хромосомы анализируется как с помощью микроскопа, так и с использованием компьютерных аналитических систем, которые существенно повышают качество и скорость исследования.

Кариотипирование проводится как минимум на двадцати хорошо окрашенных, полных метафазных пластинках с хорошим разбросом хромосом. Исследователь подсчитывает их количество и проводит оценку структуры каждой путем сопоставления двух аналогичных хромосом и сравнения их с цитогенетическими картами.

Для чего используется исследование?

  • Для выявления хромосомных аномалий в клетках костного мозга при диагностике и последующем мониторинге эффективности лечения при заболеваниях системы кроветворения.

Когда назначается исследование?

  • Для верификации диагноза и определения прогностических факторов при злокачественных новообразованиях гемопоэтической ткани (острые и хронические лейкозы, лимфомы, множественная миелома и другие моноклональные гаммапатии, миелодиспластические синдромы).
  • В целях мониторинга эффективности лечения.
  • В целях мониторинга сохранения ремиссии заболевания.

Что означают результаты?

Нормальный кариотип человека выглядит следующим образом:

46,ХХ – нормальный кариотип женщины,

46,XY – нормальный кариотип мужчины,

- где первая цифра - это общее количество хромосом, а после запятой перечислены половые хромосомы.

Количество проанализированных метафаз, а также метафаз, в которых выявлены мутации, записывается в квадратных скобках. Для записи генетических аномалий существуют специальные правила, соответственно которым будет написан результат исследования при выявлении какой-либо мутации.

Количественные аномалии хромосом записываются как их общее число, перечисление половых хромосом и номер отсутствующей или лишней хромосомы с соответствующим знаком минус или плюс.

Для обозначения структурных аномалий используются специальные буквенные символы:

t – транслокация – участок одной хромосомы переносится на другую,

del – делеция – потеря участка хромосомы,

inv – инверсия – поворот участка хромосомы на 180 градусов,

- после которых указывается номер хромосомы, на которой они обнаружены, а также ее участок.

В заключении цитогенетического исследования содержится информация о виде мутации и доле метафазных пластинок, в которой она выявлена.

Что может влиять на результат?

  • Соблюдение правил взятия и преаналитической подготовки биоматериала, опыт и квалификация врача-цитогенетика.
  • При аспирации костного мозга для нескольких анализов последние его порции могут быть значительно разведены периферической кровью. Поэтому материал для цитогенетического исследования необходимо набирать сразу после пункции. Разведение кровью приведет к невозможности получить необходимое количество метафазных пластинок, так как клетки периферической крови не находятся в состоянии деления.
  • Недостаточное количество костного мозга также может быть причиной невозможности правильного выполнения анализа.

Важные замечания

В некоторых случаях стандартное цитогенетическое исследование неинформативно. Это бывает при недостаточном количестве метафазных пластинок в исследуемом образце, а также если изменения в хромосомах слишком малы и визуально не меняют ее структуру или количество клеток с мутацией на фоне лечения значительно сократилось. В такой ситуации рекомендуется выполнение исследования методом FISH .

ККМ — клетки костного мозга

КМ — костный мозг

МСК — мезенхимальные стромальные клетки

ОМЛ — острый миелоидный лейкоз

РА — рефрактерная анемия

РАИБ — рефрактерная анемия с избытком бластов

РАКС — рефрактерная анемия с кольцевыми сидеробластами

FISH — флюоресцентная in situ гибридизация


Оценка цитогенетических аномалий в костном мозге (КМ) у больных с миелодиспластическим синдромом (МДС) имеет большое значение для подтверждения клональной природы заболевания, определения прогноза заболевания и выбора тактики лечения больных. Цитогенетические аномалии в клетках костного мозга (ККМ) выявляют у 40—70% пациентов с МДС, и их разнообразие характеризует заболевание. Так, изолированная делеция (5q) выявляется у пациентов с отдельной нозологической формой МДС, 5q-синдромом, характеризующейся своеобразной клинической картиной, хорошим ответом на иммуномодулирующую терапию и благоприятным прогнозом. Изолированная трисомия 8 позволяет отнести пациента к группе промежуточного риска и является прогностическим фактором эффективности иммуносупрессивной терапии. Аномалии 7-й хромосомы (моносомия или делеция q-плеча) определяют крайне неблагоприятный прогноз и диктуют необходимость выбора агрессивной тактики лечения, в том числе выполнения трансплантации аллогенных гемопоэтических стволовых клеток в качестве первой линии терапии. Комплексные хромосомные аномалии (3 и более) могут включать –5/del(5q), –7/del(7q), del(17p) и чаще всего ассоциируются с вторичным МДС и неблагоприятным течением заболевания. Разнообразие выявляемых генетических аномалий при МДС представлено в табл. 1 [1].

Клиническое течение МДС различно и зависит от варианта заболевания. Рефрактерные цитопении (рефрактерная анемия — РА, рефрактерная тромбоцитопения, рефрактерная нейтропения), как правило, имеют благоприятный прогноз. При увеличении количества бластных клеток в КМ (варианты РА с избытком бластов — РАИБ-1 и РАИБ-2) вероятность трансформации в острый лейкоз увеличивается, и при определении более 20% бластных клеток диагностируют острый миелоидный лейкоз (ОМЛ) с предшествующей миелодисплазией [1—5].

Развитие МДС обусловлено клональным повреждением стволовой кроветворной клетки. Происходит ли это нарушение на уровне истинно стволовой клетки или коммитированных миелоидных предшественников, остается неясным. В последние годы в литературе опубликованы данные о выявлении хромосомных аберраций в популяции гемопоэтических клеток—предшественниц CD34+ у пациентов с МДС и ОМЛ [6—10]. Указывается также на определение патологического клона не только среди миелоидных клеточных линий, но и лимфоидных [11—13], что может быть обусловлено повреждением мультипотентной стволовой клетки.

Кроветворение в КМ обеспечивается постоянным взаимодействием гемопоэтических клеток-предшественниц и клеток стромального микроокружения. Мезенхимальные стромальные клетки (МСК) являются главным компонентом микроокружения и удобной моделью для изучения in vitro. В последнее время опубликованы работы о нарушенной функции стромы при МДС, в частности нарушен механизм миграции гемопоэтических клеток-предшественниц в костномозговые ниши. При сочетанном культивировании гемопоэтических и стромальных предшественников показано, что МСК, полученные от больных с МДС, демонстрируют сниженную способность к поддержанию нормальных гемопоэтических предшественников, у них существенно снижена пластичность по сравнению с таковой у МСК, полученных из КМ здоровых лиц, что может обусловливать неэффективный гемопоэз при МДС [11, 14—18].

Рядом исследовательских групп получены данные, согласно которым в МСК не определяются характерные для МДС хромосомные аберрации, и было сделано предположение, что строма не вовлечена в клональный процесс при данном заболевании и кариотип МСК не изменен [19—21]. Однако в работах E. Flores-Figueroa и соавт. [22, 23], O. Blau и соавт. [24, 25] показано наличие хромосомных нарушений в МСК, в том числе клональных, у отдельных пациентов с МДС. Исследование экспрессии генов с помощью микрочипов демонстрирует наличие генетических аномалий МСК у пациентов с МДС, в частности с 5q-синдромом [26]. Кроме того, на непосредственное участие стромального микроокружения в развитии МДС указывают данные, полученные M. Raaijmakers и соавт. [27], об индуцированном появлении признаков дисплазии в кроветворных клетках мышей при специфическом повреждении стромы.

С учетом несомненной тесной взаимосвязи гемопоэтических и стромальных клеток-предшественниц при развитии МДС представляется важным изучение цитогенетических особенностей этих клеточных популяций у пациентов с МДС.

Материалы и методы

В работе представлены результаты обследования 35 первичных больных, полученные в момент диагностики, в период с июля 2011 г. по май 2012 г.: 29 больных, их которых с МДС (РА) — 4, с рефрактерная цитопенией с мультилинейной дисплазией (РЦМД) — 13, с рефрактерной анемией с кольцевыми сидеробластами (РАКС) — 2, с РАИБ — 7, с 5q-синдром — 3; 6 больных в стадии трансформации в ОМЛ (1 пациент с вторичным ОМЛ) и 7 здоровых доноров КМ. Диагноз устанавливали в соответствии с классификацией ВОЗ (2008) [1]. Соотношение мужчин и женщин 18/17. Медиана возраста составила 60 лет (19—77 лет).

Цитогенетическое исследование ККМ проводили прямым методом и после краткосрочного (16—24 ч) культивирования клеток. Фиксацию и приготовление препаратов хромосом выполняли по общепринятой методике. G-дифференциальную окраску хромосом (G-band) осуществляли по методике M. Seabright [28] в модификации с применением красителя Wright. Цитогенетическое исследование МСК выполняли по методу, описанному Z. Zhang и соавт. [29]. Хромосомный анализ проводили в соответствии с Международной цитогенетической номенклатурой хромосом человека (ISCN 2005) [30]. Анализировали в среднем 20 метафаз. Клональной считали аномалию при обнаружении структурной перестройки и трисомии минимум в 2 метафазах и моносомии минимум в 3. При обнаружении структурной перестройки в одной метафазе перестройку обозначали как неклональную (спонтанную). Единичные неполные митозы не учитывали ввиду возможности потерь хромосом при обработке клеточного осадка. Флюоресцентную in situ гибридизацию (FISH) выполняли на ККМ и изолированных клетках CD34+ с использованием набора ДНК-зондов LSI (5q33—q34) EGR-1 SpectrumOrange/D5S721/D5S23 SpectrumGreen Probe, LSI (7q31) SpectrumOrange/CEP 7 SpectrumGreen Probe, CEP 8 SpectrumOrange DNAProbeKit, LSIAML1/ETO Dual Color Fusion Translocation Probe, CEP X SpectrumOrange/CEPY SpectrumGreen DNA Probe, LSI D20S108 (20q12) SpectrumOrange Probe («Vysis Abbott», США). Гибридизацию осуществляли согласно методике фирмы-производителя. Анализ сигналов проводили под флюоресцентным микроскопом Zeiss-Axioscope с использованием тройного фильтра Orange/Green/Dapi. Анализировали 200 интерфазных ядер.


Гемопоэтические клетки—предшественницы СD34+ получали из КМ и периферической крови. Мононуклеарные клетки выделяли, центрифугируя в градиенте плотности фиколла, и метили CD34 MicroBeads human. Изолированную фракцию клеток CD34+ получали, используя MACS колонки для магнитной сепарации, в соответствии с инструкциями фирмы-производителя («Miltenyi Biotec», «Bergisch Gladbach», Германия). Чистота полученной фракции проверена с помощью проточной цитометрии и составила 94,5% (рис. 1). Рисунок 1. Контроль чистоты популяции клеток CD34+ после магнитной сепарации с помощью проточной цитометрии. Выделенную фракцию клеток концентрировали с помощью цитоспина на адгезивном стекле для выполнения FISH-исследования.

Культуру МСК получали из КМ. Фракцию мононуклеаров выделяли из аспирата КМ в градиенте плотности фиколла (1,077 г/см 3 ). Для получения МСК мононуклеары культивировали в пластиковых матрасах с площадью дна 25 и 75 см 2 в концентрации 1—6·10 6 клеток на флакон в среде α-МЕМ («HyClone», США) с 10% эмбриональной телячьей сывороткой («HyClone», США), 2 мМ L-глутамина («BioWest»), 100 ед/мл пенициллина и 50 ед/мл стрептомицина («Ферейн», Россия). После образования конфлюэнтного монослоя из фибробластов клетки снимали 0,05% раствором трипсина и пассировали. В большинстве исследований использовали клетки после 2—3 пассажей.

Результаты

Цитогенетическое исследование ККМ. Характеристика больных и результаты цитогенетического исследования КМ представлены в табл. 2. Нормальный кариотип определен у 19 из 35 больных, у одного из них выявлена конституциональная инверсия inv(9)(p13q21); у 13 (МДС у 11 и ОМЛ у 2) — аномалии кариотипа и у 3 делящиеся клетки не обнаружены. Спектр выделенных аномалий следующий: у 7 больных (МДС у 6 и ОМЛ у 1) выявлены изолированные del(5q), –7, i(14), inv(3); у 1 (МДС) — 2 аномалии — del(5q) и –7, и у 5 (МДС — у 3 и ОМЛ — у 2) комплексный кариотип.

У 5 (14%) из 35 больных методом FISH выявлены скрытые хромосомные аномалии, которые не определены при кариотипировании: у 2 из них (МДС) при цитогенетическом исследовании не получены митозы и методом FISH выявлены хромосомные аномалии: в первом случае — одновременно del(5q) и del(7q) в 84% клеток, во втором — трисомия 8 в 67% клеток. Еще у 2 больных (ОМЛ у 1 и МДС у 1) методом G-band определен нормальный кариотип, однако с помощью метода FISH выявлена del(5q) в обоих случаях. У 1 больного МДС, у которого в кариотипе определена изолированная del(5q), FISH-анализ позволил выявить дополнительно трисомию 21 в 52% клеток (исследование выполнено прицельно, так как имелись анамнестические данные предыдущего цитогенетического анализа у этого пациента, выявившего 2 аномалии). Таким образом, после применения метода FISH дополнительно к исследованию кариотипа число больных с цитогенетическими аномалиями в ККМ увеличилось с 13 до 17 (49%).

FISH-исследование выделенных гемопоэтических клеток—предшественниц CD34+ из КМ и периферической крови. Методом FISH проанализированы гемопоэтические клетки—предшественницы CD34+, полученные из КМ и периферической крови, у 24 из 35 пациентов (у 3 ОМЛ, у 21 МДС). У 10 из 24 пациентов в КМ определены хромосомные аномалии. Мы подтверждали эти аномалии в популяции клеток CD34+ с помощью FISH-исследования.

Цитогенетическое исследование МСК. Кариологический анализ МСК выполнен у 23 из 35 пациентов (МДС у 19 и ОМЛ у 4) и у 7 здоровых доноров КМ (см. табл. 2). У 12 больных из 35 не удалось получить рост МСК в культуре вследствие ограниченной способности стромальных клеток больных с МДС к пролиферации. Нормальный кариотип МСК определен у всех больных ОМЛ и у 6 больных с МДС, у одного из которых в кариотипе МСК определена конституциональная инверсия inv(9). У 2 (11%) из 19 пациентов с МДС выявлены аномалии кариотипа.

У одного из них с конституциональной inv(9) (пациент №12) выявлена неклональная транслокация в одной метафазе: 46ХY,t(2;22)(p10;q11), inv(9)(p13q21)[1]/46ХY, inv(9) (p13q21)[19]. У второго (пациент №21) в кариотипе МСК выявлена клональная перестройка в 7 метафазах из 20: 46ХУ,add(2q)[7]/46ХУ[13]. В КМ у этого больного определен комплексный кариотип (рис. 2). Рисунок 2. Кариотип ККМ и МСК пациента №21 И., 58 лет, диагноз: МДС, РА. а — кариотип ККМ: 45—46,XY,–5,–13,der(19),add(q13?or p13),–20,+2mar,+mar del(13q21)?,+d min. Рисунок 2. Кариотип ККМ и МСК пациента №21 И., 58 лет, диагноз: МДС, РА. б — кариотип МСК: 46,XY,add (2)(q36). У обоих пациентов с инверсией inv(9) в ККМ и МСК ее конституциональный характер был подтвержден результатами исследования кариотипа стимулированной фитогемагглютинином культуры лимфоцитов периферической крови. При кариотипировании МСК от здоровых доноров КМ во всех исследованных образцах получен нормальный кариотип.

В настоящей работе представлен анализ цитогенетических изменений в популяциях гемопоэтических и стромальных клеток-предшественниц у пациентов с различными вариантами МДС, а также в стадии трансформации заболевания в ОМЛ. Интерес к изучению этой области определяется тем, что до сих пор остается неуточненным вопрос об истинном уровне генетического повреждения при МДС, а также участии стромального микроокружения в патогенезе клональной эволюции миелодисплазии.

Определение кариотипа ККМ в настоящее время входит в перечень стандартных исследований, необходимых для верификации диагноза МДС. Выявленные хромосомные аномалии определяют прогноз заболевания и соответственно тактику лечения больных. Современные прогностические шкалы, в частности шкала IPSS-R, помимо количества бластных клеток в КМ, степени цитопении и зависимости от гемотрансфузий, включают данные цитогенетического анализа [31]. В нашем исследовании цитогенетические аномалии в КМ обнаружены у 17 (49%) из 35 обследованных, что коррелирует с данными литературы [1—5]. Стоит еще раз отметить, что не во всех случаях метод стандартного цитогенетического исследования явился достаточным для обнаружения аномалий кариотипа, и у около 10% пациентов не удалось получить делящиеся клетки для анализа. По меньшей мере в 14% случаев (по нашим данным, у 5 из 35 больных) методом FISH могут быть выявлены дополнительные (скрытые) хромосомные аномалии. У всех 5 больных размер выявленных клонов был довольно велик (от 52 до 84%); такие клоны не могут быть незамеченными при хромосомном анализе. По-видимому, все эти клетки находятся в стадии G0, не выходят в митоз и поэтому не обнаруживаются при кариотипировании. У 1 из 5 пациентов с выявленной del(5q) неразделившиеся клетки содержали вторую аномалию — трисомию 21. Можно предположить, что у этого больного наблюдалось 2 клона клеток в КМ — один только с del(5q) и второй одновременно с del(5q) и трисомией 21. Выявление дополнительных хромосомных аномалий у ряда пациентов может иметь принципиальное значение, так как от этого зависят и прогноз заболевания, и терапевтический подход. Так, при определении нормального кариотипа в ККМ может быть выбрана тактика динамического наблюдения с последующими исследованиями КМ, тогда как выявление del(5q) позволяет эффективно применять иммуномодулирующую терапию. Следовательно, в дебюте заболевания всем пациентам целесообразно сначала проводить стандартное цитогенетическое исследование, и в случаях определения нормального кариотипа или отсутствия делящихся клеток необходимо выполнять FISH-исследование с целью определения клинически значимых хромосомных аномалий. Всем пациентам, не дожидаясь получения результатов кариотипирования, проводить FISH-исследование нецелесообразно [32].

В клетках CD34+, выделенных из КМ и периферической крови, определены те же клональные нарушения, что и в ККМ пациентов с аномалиями кариотипа, что подтверждает поражение гемопоэтических предшественников при МДС. По данным литературы, количество клеток—предшественниц CD34+ в КМ больных МДС значительно больше, чем у здоровых лиц, пациентов с апластической анемией и вторичными цитопеническими синдромами. Процент клеток CD34+ неоднороден у пациентов категорий низкого (1,7%) и высокого (10,5%) риска и максимальный у пациентов с ОМЛ (35%), он коррелирует с процентом бластных клеток и немного превышает его [33]. Количество циркулирующих клеток CD34+ у пациентов с МДС также значительно больше, чем у здоровых лиц, и зависит от процентного содержания их в КМ [34]. Наряду с увеличением количества бластных клеток, увеличение количества клеток CD34+ тоже может свидетельствовать о прогрессии заболевания. В нашем исследовании выявлено, что в среднем процент клонально измененных клеток среди гемопоэтических предшественников не отличается от такового в общей популяции ККМ пациентов с аномалиями кариотипа. Однако у 4 из 10 больных отличия выявлены. Согласно нашим наблюдениям размер патологического клона в клетках CD34+ может быть как значительно больше, так и меньше размера клона в общей популяции ККМ. Возможно, выраженность клональных изменений в гемопоэтических клетках-предшественницах может свидетельствовать о динамике развития заболевания и иметь прогностическое значение. Ввиду того что результаты FISH-исследования циркулирующих клеток СD34+ в среднем сопоставимы с результатами исследования ККМ, цитогенетический контроль динамики заболевания в процессе лечения при наличии маркеров для FISH-исследования может осуществляться с использованием изолированной фракции клеток CD34+ или мононуклеарной фракции периферической крови, что поможет снизить кратность пункций КМ у пациентов с МДС. У пациентов с нормальным кариотипом хромосомные перестройки не обнаружены и в популяции клеток CD34+. Таким образом, детальное цитогенетическое исследование (стандартное цитогенетическое исследование и FISH) не выявило у пациентов с нормальным кариотипом в КМ «скрытых» хромосомных аномалий в гемопоэтических предшественниках CD34+.

Почти у 90% пациентов с МДС и у всех пациентов с ОМЛ в нашем исследовании определен нормальный кариотип МСК. Хромосомные аномалии МСК выявлены у 2 (11%) из 19 пациентов с МДС. У обоих выявлены структурные аномалии: у одного — 35% клон add(2q), у другого — с конституциональной хромосомной нестабильностью, inv(9)(p13;q21) — единичный митоз с t(2;22)(p10;q11). Учитывая, что у пациента с клональными изменениями кариотипа МСК в ККМ обнаружен комплексный кариотип, можно предположить, что генетическая нестабильность стромы обусловлена множественными цитогенетическими аномалиями в кроветворных клетках. Численные аномалии кариотипа МСК не выявлены ни в одном случае.

Как упоминалось выше, в литературе есть публикации, согласно которым хромосомные аномалии в МСК у пациентов с МДС не определяются [19, 20]. По-видимому, причина заключается в использовании разных методов цитогенетического анализа, так как авторы с целью определения аномалий кариотипа МСК применяли только FISH-исследование с выявленными в ККМ цитогенетическими маркерами и не исследовали кариотип МСК, тогда как выявленные нами аномалии МСК определяются только при кариотипировании. Таким образом, в МСК у пациентов с МДС, действительно, не определяются характерные для ККМ цитогенетические аномалии, однако возможны отличные от них аберрации. В работах E. Flores-Figueroa и соавт. [22, 23] и Lu-Xi Song и соавт. [35] описаны аномалии кариотипа МСК более чем у 50% обследованных пациентов с МДС, в основном за счет неклональных потерь отдельных хромосом. Однако встречающиеся отдельные неполные митозы нами не учитывались, так как подобные ситуации могут встречаться вследствие технических особенностей обработки клеточного осадка. O. Blau и соавт. [25] описывают клональные структурные аномалии МСК у 16% пациентов с МДС и ОМЛ. Результаты нашего исследования сопоставимы с результатами O. Blau, однако мы не выявили аномалии кариотипа МСК у пациентов в стадии трансформации МДС в ОМЛ.

Заключение

Таким образом, несмотря на небольшое число проанализированных больных, на основании проведенного исследования можно сделать заключение, что в гемопоэтических и мезенхимальных клетках-предшественницах у пациентов с МДС определяются разные цитогенетические аномалии. В клетках CD34+, выделенных из КМ и периферической крови, выявлены те же аномалии, что и в общей популяции ККМ. У 11% пациентов с МДС выявлены аномалии кариотипа МСК, что указывает на генетическую нестабильность стромы при этом заболевании и подверженность возникновению хромосомных поломок. Различия хромосомных аномалий, определяемых в гемопоэтических и мезенхимальных клетках-предшественницах, подтверждают, что клетки стромального микроокружения в отличие от гемопоэтических предшественников не являются частью патологического клона при МДС, однако, вероятно, играют важную роль в патогенезе развития заболевания.

Диагностика хронических лейкозов с применением методов молекулярной цитогенетики. Особенности методологии

Цитогенетические методы исследования клеток костного мозга и периферической крови у лиц с онкогематологическими диагнозами широко используются для диагностики заболеваний и оценки их степени тяжести. Разнообразие методов окраски хромосом позволяет наиболее полно оценить генетические аномалии, что важно для определения тактики лечения и прогноза течения заболеваний. Поскольку лаборатории часто ограничены в финансовых средствах, важно выработать подходы для выбора цитогенетического метода анализа. Цель настоящей работы заключалась в анализе цитогенетической патологии в клетках костного мозга у лиц с хроническими формами лейкозов с применением трех методов окраски, что позволило сформировать методологию цитогенетического исследования для разных групп заболеваний (хронический миелолейкоз, хронический лимфолейкоз, множественная миелома, первичный миелофиброз). В работе были использованы: дифференциальное GTG-окрашивание, 24-цветный FISH. У лиц с хроническим лимфолейкозом (ХЛЛ) препараты окрашивались с использованием локусспецифичных зондов: ATM(11q22)/TP53(17p13) и DLEU(13q14)/LAMP(13q34)/cen12(12p11.1;12q11.1). Результаты исследования позволили заключить: дифференциальное окрашивание позволяет выявить все структурные перестройки хромосом, но только при идеальном качестве препарата, что при работе с костным мозгом бывает не часто. Использование 24-цветного FISH позволяет выявить транслокации, даже если качество хромосом не очень хорошее. Метод хорошо зарекомендовал себя для поиска комплексных транслокаций. Коктейль локусспецифичных зондов при ХЛЛ показал высокие эффективность и скорость получения результатов. Цитогенетический анализ в динамике позволяет оценить особенности мутационного процесса в ходе лечения.

Ключевые слова

Об авторе

Список литературы

2. Гариффулин А.Д., Волошин С.В., Мартынкевич И.С., Клеина Е.В,, Салогуб Г.Н., Карягина Е.В., Абдулкадыров К.М., Чечеткин А.В. Генетические аномалии: влияние на эффективность терапии, выживаемость больных множественной миеломой, роль в оценке минимальной остаточной болезни. Медицинская генетика.2016;9:29-39.

3. Мещерякова Л.М., Пороткова О.В., Ковалева Л.Г., Колосова Л.Ю., Бычкова С.Н. Первичный миелофиброз. Онкогематология. 2011; 4:50-57.

4. Vozilova A.V., Shagina N.B., Degteva M.O., Akleyev A.V. Chronic radioisotope effects on residents of the Techa River (Russia) region: Cytogenetic analysis more than 50 years after onset of exposure. Mutation Research.2013.756 (1-2):115-118.

5. Estandarte Ana Katrina C. A Review of the Different Staining Techniques for Human Metaphase Chromosomes Submitted in partial fulfillment of the requirements for the degree of Masters in Research at the University of London February 24, 2012.

7. Macdonalda D., Reiterb A., Cross N. The 8p11 Myeloproliferative Syndrome: A Distinct Clinical Entity Caused by Constitutive Activation of FGFR1. Acta Haematol 2002;107:101-107.

8. Гиндина Т.Л., Мамаев Н.Н., Байков В.В., Барабанщикова М.В., Николаева Е.Н., Петрова И.А., Моисеев И.С., Пирогова О.В., Власова Ю.Ю., Иванова М.О., Морозова Е.В., Бондаренко С.Н., Афанасьев Б.В. Новые горизонты цитогенетики при первичном миелофиброзе. Клиническая онкогематология. Фундаментальные исследования и клиническая практика. 2016;9(1):61-69.

9. Loucas BD, Shuryak I, Cornforth MN. Three-Color Chromosome Painting as Seen through the Eyes of mFISH: Another Look at Radiation-Induced Exchanges and Their Conversion to Whole-Genome Equivalency. Front Oncol. 2016 Mar 15;6:52. doi: 10.3389/fonc.2016.00052.

10. Д.Ф. Глузман Л.М., Скляренко Т.С., Иванивская С.В., Коваль Н.К., Родионова Н.И., Украинская Л.Ю., Полудненко А., Джалилов Хронический лимфолейкоз: лабораторная диагностика и критерии прогноза. Онкология. 2014;16(3):171-176.

Первый Санкт-Петербургский
государственный медицинский
университет им. акад. И.П. Павлова

Клиника «НИИ детской онкологии, гематологии и трансплантологии им. Р.М.Горбачевой»

Контактная информация Клиники:

Регистратура

Отделение организационно-методической работы и статистики

Директор Кулагин Александр Дмитриевич, д.м.н., профессор

Заместитель директора по научной работе Моисеев Иван Сергеевич, д.м.н., доцент

Заместитель директора по лечебной работе Бондаренко Сергей Николаевич, к.м.н., доцент

Заместитель директора по педиатрии Маркова Инна Викторовна, ассистент

Заместитель директора по трансплантации Зубаровская Людмила Степановна, д.м.н., профессор

Клиника НИИ ДОГиТ им. Р.М. Горбачевой является базой кафедры гематологии, трансфузиологии и трансплантологии ФПО.

Научные отделы НИИ ДОГиТ им. Р.М. Горбачевой:

руководитель отдела - д.м.н., профессор Зубаровская Людмила Степановна

руководитель отдела - к.м.н., доцент Морозова Елена Владиславовна

руководитель отдела онкологии - к.м.н., доцент Михайлова Наталья Борисовна

руководитель отделения - Певцов Дмитрий Эдуардович

Отдел клинического питания

Руководитель отдела - д.м.н., доцент Кучер Максим Анатольевич

Научный отдел хранения и исследования биологических объектов «Биобанк»

руководитель отдела - Серов Юрий Арнольдович

руководитель отдела - д.м.н., профессор Галибин Олег Всеволодович

Клинические подразделения НИИ ДОГиТ им. Р.М. Горбачевой:

Отдел детской онкологии, гематологии и трансплантологии

  • Отделение трансплантации костного мозга для детей №1
  • Отделение трансплантации костного мозга для детей №2
  • Отделение трансплантации костного мозга для детей с орфанными заболеваниями
  • Консультативно-диагностический кабинет
  • Отделение восстановительной медицины
  • Приемное отделение №3
  • Операционный блок №8
  • Отделение организационно-методической работы и статистики
  • Отделение госпитальных регистров
  • Лаборатория патоморфологии
  • Лаборатория трансплантологии и молекулярной гематологии
  • Лаборатория цитогенетики и диагностики генетических заболеваний
  • Технический отдел отдела детской онкологии, гематологии и трансплантологии


Отдел онкологии и трансплантологии для подростков и взрослых

  • Отделение трансплантации костного мозга для взрослых
  • Отделение реанимации и интенсивной терапии №3
  • Отделение анестезиологии и реанимации №3
  • Гематологическое отделение
  • Палаты реанимации и интенсивной терапии гематологического отделения


Отдел клинического питания


Отдел клинической онкологии

  • Онкологическое отделение №2 (химиотерапии и трансплантации костного мозга)


Отдел трансфузиологии, иммунологии и клеточных технологий

  • Отделение клинической трансфузиологии
  • Отделение криоконсервации с лабораторией контроля качества гемопоэтических клеток
  • Лаборатория тканевого типирования
  • Лаборатория трансплантационной иммунологии
  • Лаборатория «Регистр доноров костного мозга»
  • Отделение переливания крови
  • Трансфузиологический кабинет


Поликлиническое отделение со стационаром дневного пребывания для взрослых

Поликлиническое отделение со стационаром дневного пребывания для детей

Мероприятия

Приоритетные направления работы клиники

Клиника НИИ ДОГиТ им. Р.М. Горбачевой являются ведущим центром трансплантации гемопоэтических стволовых клеток в России. В клинике выполняется более 400 различных видов ТГСК в год у пациентов с болезнями крови, онкологическими, наследственными заболеваниями. Наряду с трансплантационной программой клиника НИИ ДОГИТ специализируется на современной таргетной и иммунотерапии терапии, интенсивной химиотерапии. Специалистами клиники выполняется полный спектр диагностических исследований в гематологии и онкологии.

Лабораторная диагностика

Лаборатория цитогенетики и диагностики генетических заболеваний

Руководитель – д.м.н., Гиндина Татьяна Леонидовна

В лаборатории проводится широкий спектр генетических исследований:

  • Стандартное цитогенетическое исследование – оценка кариотипа (кариотипирование клеток) для обнаружения структурных и численных аномалий хромосом с использованием различных методов их дифференциального окрашивания.
  • Тест на патологическую ломкость хромосом – для диагностики конституциональных заболеваний, сопровождающихся нарушением репарации ДНК.
  • Флуоресцентная in situ гибридизация (FISH) – молекулярно-цитогенетический метод с применением ДНК-зондов для выявления хромосомных перестроек и слитных химерных генов, обладающих прогностической и диагностической информацией. Проводятся все современные варианты флуоресцентной in situ гибридизации, включая многоцветное кариотипирование и многоцветное бендирование хромосом.FISH-диагностика при острых миелоидных лейкозах, миелодиспластических синдромах и миелопролиферативных новообразованиях включает определение транслокаций t(8;21)/RUNX1-RUNX1T1, t(15;17)/PML-RARA, t(6;9)/DEK-NUP214, inv(16)/CBFB-MYH11, t(9;22)/BCR-ABL1; перестроек генов NUP98, MECOM/EVI1, KMT2A(MLL); делеций хромосом 5, 7, 20; гена ТР53 и др.

  • Проводится диагностика гиперэозинофильного синдрома с перестройками генов PDGFRA/FIP1L1, PDGFRB, FGFR1, JAK2.
  • Молекулярно-цитогенетическое исследование при острых лимфобластных лейкозах нацелено на выявление транслокаций t(9;22)/BCR-ABL1, t(12;21)/ETV6-RUNX1, t(1;19)/t(17;19)/E2A, перестроек гена KMT2A(MLL);амплификации iAMP21(RUNX1); гипердиплоидного кариотипа; BCR-ABL1-подобных, Т-линейных лейкозов и др.
  • Выполняется генетическая диагностика прогностических аберраций при хроническом лимфолейкозе (делеций хромосом 13 (RB1), 11 (АТМ), 17 (ТР53), 6 (MYB) и трисомии 12-й хромосомы), а также неходжкинских лимфомах (перестройки генов c-MYC, CCND1, CCND3, BCL2, BCL6, MALT, ALK, IGH, IGK, IGL) на образцах из клеточных суспензий или парафиновых блоков.
  • В лаборатории осуществляется комплексная генетическая диагностика множественной миеломы с оценкой риска по основным хромосомным аберрациям: транслокациям t(4;14)/FGFR3-IGH, t(14;16)/MAF-IGH, t(14;20)/MAFB-IGH, t(11;14)/CCND1-IGH; гипердиплоидии; делеции гена ТР53, аномалиям 1-й и 13-й хромосомы (флуоресцентная in situ гибридизация для диагностики множественной миеломы).

Лаборатория трансплантологии и молекулярной гематологии

Читайте также: