Фармакогеномика: определение, задачи

Обновлено: 15.06.2024

Обычно лечение рака носит эмпирический характер и основано скорее на клинических данных, чем на понимании механизмов чувствительности к химическим агентам. Например, схемы химиотерапии обеспечивают 30-50% ремиссий у ранее нелеченых больных, и в распоряжении врачей существует лишь немного способов прогнозирования тех больных, у которых произойдет ремиссия, и выявления тех, у которых ремиссии не будет. В результате больные часто подвергаются воздействию высокотоксических препаратов и страдают от побочных эффектов в отсутствие каких-либо положительных результатов. Существует огромное количество данных, указывающих на то, что имеются не только десятки генов-супрессоров опухолей, которые воздействуют на поведение рака легкого, но важны также и эпигенетические изменения, такие как гиперметилирование, когда функция гена оказывается выключенной без мутации. Это происходит, например, в промоторной области ключевых генов-супрессоров опухоли, таких как MGMT и MLH1, которые участвуют в формировании резистентности к цисплатину. Эта резистентность не была продемонстрирована клинически, поскольку трудно получить несколько серийных биопсий у одного и того же больного, а методы определения метилирования были разработаны лишь недавно. Необходимость получения серийных биопсий для выделения ДНК недавно была разрешена, поскольку мы знаем, что мы можем получить ДНК из сыворотки больных в любое время в ходе лечения и последующего срока наблюдения. Это обстоятельство является критически важным, поскольку цисплатин в течение длительного времени оставался главным стержнем химиотерапии. Если мы окажемся в состоянии выявлять, какие больные будут резистентны к цисплатину, мы сможем индивидуально изменять химиотерапию, поскольку недавно было показано, что эффективностью обладают и некоторые комбинации новых агентов, включая таксаны, без добавления цисплатина. Для решения этих вопросов необходимы фармакогеномные исследования.

Транскрипционный статус р53 определяет чувствительность к препаратам, влияющим на микротрубочки, причем эта чувствительность реализуется через транскрипционную регуляцию гена MAP4. Продукт гена MAP4 является мажорным белком, связанным с микротрубочками и присутствующим в клетках, не являющихся клетками нервной ткани. Повышенная экспрессия MAP4, наблюдающаяся в таких случаях, когда транскрипция гена р53 неактивна, повышает степень полимеризации микротрубочек и связывание ТАКСОЛА. Это изменение приводит к повышению чувствительности к ТАКСОЛУ. Таким образом, регулируемые через р53 изменения экспрессии MAP4 могут менять динамическую стабильность микротрубочек и воздействовать на чувствительность к препаратам, влияющим на микротрубочки. Соответственно, изменения в хемочувствительности после введения препаратов, повреждающих ДНК, не наблюдаются в клетках, несущих мутантную форму р53. Эти исследования формируют основу для будущего прицельного создания комбинированных схем лечения. Этот подход является основой испытания по последовательной химиотерапии при немелкоклеточном раке легкого, проводящегося Университетом Калифорнии в Дэвисе, и испытания последовательной химиотерапии SWOG 9806 по фазе II; оба эти испытания основаны на том факте, что агенты, повреждающие ДНК, индуцируют мутации р53, и таксаны при их последующем введении могут оказываться более эффективными.

Существует масса данных о том, что при определении стадии рака легкого обычно допускается ошибка в сторону более ранних стадий. Например, при операбельных формах немелкоклеточного рака легкого можно серьезно подозревать наличие скрытых микрометастазов. В клинической практике исследователи могут выделять опухолевую ДНК из сыворотки больных, что может быть чрезвычайно полезным для определения того, что даже на ранних стадиях заболеваниях немелкоклеточный рак легкого представляет собой диссеминированное заболевание. Первый признак микрометастазов в кровотоке был обнаружен у больных с мелкоклеточным раком легкого, когда в плазме 15 из 21 больного (71%) были обнаружены изменения микросателлитов ДНК. Изменения микросателлитов также обнаруживались в сыворотке 6 из 21 (29%) больного с плоскоклеточной карциномой головы и шеи. Мы обнаружили такие изменения в сыворотке 6 из 22 (27%) больных с немелкоклеточным раком легкого. Используя полимеразную цепную реакцию во флуоресцентном варианте и автоматический секвенатор ДНК, изменения микросателлитов были обнаружены в плазме 25 из 40 (63%) больных с карциномой почки.

Мы сосредоточили наши исследования, связанные с ТАКСОЛОМ, на скрининге мутации b-тубулина в экстрацеллюлярной ДНК в кровотоке. Связывающиеся с тубулином лекарственные препараты из семейства таксанов оказывают непосредственное действие путем стабилизации полимеров тубулина во время образования митотического веретена. Однако существуют более отдаленные этапы на пути апоптоза, особенно те, которые связаны с функциями митохондрий. Например, цитотоксичность ТАКСОЛА связана с фосфорилированием Bcl-2 и Raf-1; другие непосредственные эффекты ТАКСОЛА стимулируются в присутствии Bax. Откачка ТАКСОЛА из клетки нарушается в клетках с гиперэкспрессией Bax. Далее, Bcl-2 и Bcl-XL подавляют выход цитохрома с из митохондрий, в то время как обладающий стимулирующим действием на апоптоз белок Bax подавляет освобождение цитохрома с. Bax и косвенно также BAD способствуют остановке клетки на стадии G2/M b клеточного цикла после повреждения тубулина. Митохондриальный геном может играть важную роль в реакции раковых клеток на лекарственные препараты. Повышенное повреждение митохондриальной ДНК противораковыми препаратами было описано в качестве одного из механизмов цитотоксичности. В нашем более раннем исследовании мы провели секвенирование гена b-тубулина (HM40) у 49 больных с НМРЛ, получавших лечение ТАКСОЛОМ в форме монотерапии. У 16 из них (33%) присутствовали мутации в тубулине, и ни в одном случае не отмечалось реакции на ТАКСОЛ; у всех этих больных время выживания было значительно меньшим, чем у больных без мутаций по тубулину.

В настоящем исследовании для упрощения мы сосредоточили внимание на оценке клинического значения тубулиновых мутаций как одного из механизмов резистентности. В настоящее время мы проводим секвенирование всех четырех экзонов, используя три независимых ПЦР. Качественная ПЦР в реальном времени позволяет определить точное количество копий ДНК, которые подверглись амплификации. Экзоны 2 и 3 амплифицируются совместно, а экзон 4 амплифицируется в отдельной ПЦР. Мы проводим секвенирование гена НМ40 в соответствии с работой, выполненной Джианнакаку. Недавно Gonzalez-Garay и соавт. обнаружили резистентность к ТАКСОЛУ в клеточных линиях СНО, причем за резистентность отвечал кластер мутаций, влияющих на положения Leu 215, Leu 217 и Leu 228. Это наблюдение показывает, что лейциновый кластер является важным структурным мотивом для сборки микротрубочек. Далее, недавняя публикация электронной карты структуры кристалла тубулина показывает, что мутации в кодонах 215 и 217 приходятся на петлю, соединяющую спирали Н6 и Н7, в то время как мутация 228 находится в составе спирали Н7. Это та же самая область (217—231), которая под влиянием света образует сшивку с 2-(m-азидобензоил)таксолом. Недавнее уточнение кристаллической структуры тубулина подтверждает участие петли Н6—Н7 как в продольных, так и в боковых контактах. Фармакофор, состоящий из Arg 282 и Thr 274, был описан в 7BzDC-таксоловом конформере, состыкованном в электронной карте кристаллической структуры b-тубулина из А549—Т12-резистентных клеток. С другой стороны, пока не было убедительно показано, что за фенотип лекарственной устойчивости отвечает изменение экспрессии изотипов b-тубулина. Мы исследуем возможность выявления тубулиновых мутаций в ДНК из крови больных с распространенной формой немелкоклеточного рака легкого. Мы высказываем предположение, что у не дающих ремиссии больных будут обнаружены соответствующие генотипы по тубулину. Мы выделили ДНК из сыворотки периферической крови 150 больных с немелкоклеточным раком легкого и сравнили ее с ДНК, полученной от 120 контрольных лиц. ДНК выделяли из сыворотки и образцов клеток крови с использованием наборов для крови Qiagen в соответствии с протоколом, описанным для крови. Наши предварительные результаты показывают, что мутации b-тубулина были обнаружены у 18 из 30 больных. Мутации тубулина были обнаружены у 16 из 24 (66,7%) больных со стадией IIIB и IV и у двух из шести (33,3%) больных на стадии I-IIIA, у которых также присутствовала ДНК в крови. Двадцать четыре больных на стадиях IIIB и IV получали химиотерапию первой линии. Из этих 24 больных 13 получали терапию второй линии, шесть терапию третьей линии, три четвертой линии и два еще и дополнительные режимы химиотерапии. Это исследование продолжается, окончательные результаты по выживаемости отсутствуют. Резюмируя эти данные, можно сказать, что описанные мутации на экспериментальном и клиническом уровне вероятно способны создавать резистентность к ТАКСОЛУ. Наша предварительная оценка подтверждает наличие тубулиновых мутаций в ДНК сыворотки у больных с немелкоклеточным раком легкого. В экспериментальных моделях антисенс олигонуклеотиды к b-тубулину класса III резко понижали экспрессию мРНК в резистентных к ТАКСОЛУ клетках рака легкого А549-Т24. Эта экспериментальная модель открывает подход, основанный на применении антисенс-олигонуклеотидов для преодоления резистентности к ТАКСОЛУ в клетках немелкоклеточного рака легкого с гиперэкспрессией b-тубулина.

Резюмируя, следует сказать, что существует много потенциальных генов-мишеней для фармакогеномной химиотерапии. Помимо мутаций тубулина, мы анализируем характер метилирования MGMT и его связь с мутациями K-ras и down-регулирование гомеобоксного гена-репрессора опухоли Cdx-2. Другими потенциальными генами-мишенями для гиперметилирования являются тромбоспондин-1, который представляет собой ингибитор ангиогенеза, регулируемый р53 и Rb, версикан, ген которого регулируется Rb, а-тубулин и hMLH1. В рамках теоретических моделей по созданию индивидуализированной химиотерапии мы можем предвидеть, что одной из основных задач будет варьирование нагрузки на ДНК от исходных моментов лечения до завершения.

Неоадъювантная химиотерапия исследуется при НМРЛ на стадиях I-II. Однако целесообразно стремиться к лучшей оценке прогноза, и технический прогресс может позволить выявлять микрометастазы на молекулярном уровне. Периодическая проверка наличия ДНК в сыворотке может исключить присутствие микрометастазов в кровотоке до и после неоадъювантной химиотерапии, а также до и после хирургической операции. Испанская группа по раку легкого (SLCG) и швейцарская группа по раку легкого (SAKK) планируют провести европейское рандомизированное испытание, в котором больные на стадиях НМРЛ I-II будут получать неоадъювантную химиотерапию (ТАКСОЛ 200 мг/м 2 +карбоплатин по критерию площади под кривой концентрация-время [AUC] 6 ), после чего будет выполняться хирургическая операция или же будет проводиться хирургическая операция с последующими тремя курсами той же схемы химиотерапии. В этом испытании сформулированы восемь конкретных генетических целей: (1) провести скрининг на мутации тубулина; (2) выявить корреляцию между тубулином и K-ras с рецидивами и выживанием; (3) исследовать потерю гетерозиготности по локусу 9p21; (4) провести испытание информативности редких аллелей H-RAS1 VNTR; (5) выявить остаточное заболевание; (6) установить корреляцию между генетическими дефектами с одной стороны и рецидивированием и выживаемостью с другой; (7) исследовать гиперметилирование p16, MGMT, MLH1 и тромбоспондина-1; (8) выяснить, будет ли мутация K-ras, присутствующая до начала лечения, исчезать после проведения химиотерапии. Для анализа наличия изменений в ДНК, находящейся в кровотоке, будет использована общая линейная модель. В будущем генотипирование лекарственной резистентности ДНК сможет привести к индивидуализации химиотерапии у больных, дающих рецидив заболевания.

Фармакогеномика. Ее значение для разработки новых лекарственных средств

Фармакогеномика — новая быстро развивающаяся наука — «сплав» фармакогенетики и современные геномные технологии. Внедрение фармакогеномики в практику экспериментальной фармакологии и клинической медицины стало возможным в результате совершенствования методов генетического анализа в ходе выполнения Проекта человеческого генома. Выявление генетических факторов, которые детерминируют индивидуальные особенности реакции организма на действие медикаментов, позволит целенаправленно разрабатывать лекарственные препараты для определенных групп пациентов. Фармакогеномика поможет сократить расходы фармацевтических компаний на создание новых лекарственных препаратов, ускорить их разработку, повысить терапевтическую эффективность и свести к минимуму вероятность развития побочных реакций, обусловленных применением этих препаратов. Одновременно она потребует применения в клинической практике новых диагностических и прогностических тестов, необходимых для проведения рационального медикаментозного лечения.

Эффективность и безопасность лекарственных средств зависит от генетических факторов

Во второй половине 50-х годов ХХ столетия было установлено, что индивидуальная вариабельность реакции организма на действие лекарственных средств может быть обусловлена генетическими факторами. Тогда же было сформулировано и понятие о фармакогенетике как о науке, изучающей влияние генетических факторов на особенности реакции организма в ответ на медикаментозное воздействие. Известно, что один и тот же ген у разных людей может быть представлен различными вариантами (аллелями). Генетический полиморфизм имеет место в тех случаях, когда носители каждого из аллелей составляют не менее 1–2% человеческой популяции. В последние годы накопилось большое ко личество данных о генах, которые кодируют синтез белковых молекул, оказывающих влияние на процессы всасывания, распределения, метаболизма и выведения лекарственных средств. В связи с полиморфизмом таких генов у некоторых пациентов лекарственные препараты могут быть неэффективными или оказывать выраженное токсическое воздействие. Известно, например, что в норме у различных групп исследуемых людей скорость элиминации лекарства из организма может отличаться в 4–40 раз. С учетом полиморфной экспрессии ферментов системы цитохрома Р450 (CYP2D6, CYP2C9 и CYP2C19) человеческую популяцию можно разделить на две группы: «медленно» и «быстро» метаболизирующих некоторые лекарственные вещества. При этом скорость метаболизма лекарств у представителей разных групп может отличаться в 10–100 раз. Соответственно возможно развитие побочных реакций в ответ на прием лекарственных препаратов в обычных дозах. Так, по данным Американской медицинской ассоциации в США в 1994 г. развитие побочных реакций явилось причиной госпитализации 2 млн человек и более 100 тыс. случаев смерти. В последние годы побочные реакции на прием лекарственных препаратов занимают 4–6-е место среди причин смерти в США. Большинство из них обусловлено полиморфизмом генов, детерминирующих метаболизм лекарственных средств.

Развитие фармакогеномики

До настоящего времени лекарственные препараты разрабатывали и назначали на «популяционной» основе, без учета индивидуальных особенностей реакции организма. В среднем 10–40% людей не реагируют на фармакотерапию. В течение десятилетий фармакогенетические исследования носили академический характер и были в основном направлены на биохимическое изучение полиморфизма ферментов, метаболизирующих лекарственные вещества. Это было обусловлено отсутствием методов, позволяющих использовать данные фармакогенетических исследований для разработки лекарственных препаратов в фармацевтической промышленности и применения в клинической практике. Реализация Проекта человеческого генома способствовала быстрому совершенствованию новых геномных технологий, сопровождалась накоплением большого количества генетической информации, созданием различных баз данных (в том числе генетического типирования населения или групп пациентов с определенными заболеваниями) и развитием средств биоинформатики для их анализа. Качественный ска чок в развитии методов идентификации и анализа генов, в том числе обусловливающих развитие различных заболеваний или определяющих особенности реакции организма на лекарственные вещества, способствовал развитию фармакогеномики. Выявление генов, детерминирующих реакции на фармакологические средства, позволяет разработать прогностические тесты, которые дают возможность определить еще до начала проведения медикаментозного лечения вероятность развития побочной реакции у конкретного пациента. Преимущества применения таких тестов очевидны. Во-первых, лечение станет более эффективным, поскольку пациенту сразу будут назначать именно «его» лекарственный препарат. Во-вторых, выбор оптимального метода фармакотерапии на самом раннем этапе лечения и снижение вероятности развития побочных реакций будут способствовать более четкому соблюдению режима лечения пациентом и сокращению медицинских расходов. В-третьих, идентификация генетических факторов вариабельности реакции организма на лекарственные средства поможет разрабатывать новые, более эффективные лекарственные препараты.

Значение фармакогеномики
для фармацевтической промышленности

Сегодня во многих странах мира принимаются меры по ограничению расходов на медикаментозное лечение. В то же время крупные фармацевтические компании разрабатывают меньше новых активных соединений, чем это необходимо для сохранения 10% темпа роста объемов производства, обеспечивающего нормальное развитие фармацевтических предприятий. Дефицит инноваций привел к тому, что если затраты на научные исследования и разработки в 70-х годах составляли 11–12% от объема продаж фармацевтической продукции, то в 1994–1999 гг. — 19–21%. Одновременно возрастают расходы на исследование и разработку лекарственных препаратов, в том числе на проведение клинических испытаний. Известно также, что около 90% потенциальных лекарственных препаратов «отсеиваются» на этапе проведения клинических испытаний. В большинстве случаев это связано с недостаточной эффективностью или безопасностью исследуемых веществ. Таким образом, фармацевтическая промышленность нуждается в коренном изменении методов поиска и разработки новых лекарственных сре дств.

Фармакогеномика поможет решить эти задачи, так как будет способствовать выявлению оптимальных «мишеней» для фармакологического воздействия, отсеву неперспективных соединений на доклинических этапах их разработки, целенаправленному отбору групп пациентов для проведения клинических испытаний. В то же время создание лекарственных препаратов для лечения отдельных групп пациентов приведет к большей фрагментации рынка.

Недавно вице-президент компании «Glaxo Wellcome» А. Роузес в одном из интервью заметил, что когда больной идет к врачу, его интересуют только 4 вещи: диагноз должен быть точен в 100% случаев, эффективность лекарственного средства — 100%, побочные эффекты — 0% и все это должно предоставляться бесплатно. «Мы будем работать над первыми тремя проблемами», — отметил он. Учитывая эти потребности, биотехнологические компании стали предлагать услуги в проведении исследований по фармакогеномике. Некоторые компании создают базы данных медицинской информации и данных генотипирования больных с определенной патологией. Компании, имеющие геномные базы данных, объединяют их с данными по фармакогеномике и предлагают крупным фармацевтическим компаниям сотрудничество в разработке новых лекарственных средств и оптимизации применения уже используемых препаратов. Кроме того, они разрабатывают диагностические тесты для экспериментального и клинического применения.

Разработка клинических фармакогеномных тестов

Сегодня широко обсуждаются возможности разработки тестов, позволяющих одновременно определять весь «генетический профиль» пациента. Однако пока такие тесты не разработаны. В ближайшем буду щем, очевидно, будут применять фармакогеномные тесты, благодаря которым появится возможность определить вероятность возникновения побочных реакций, развивающихся в результате применения конкретного лекарственного препарата или группы лекарственных средств, которые метаболизируются в организме аналогичным образом. Однако для практического применения в клинических целях необходимо, чтобы такие тесты отвечали ряду требований. Они должны быть относительно недорогими и предупреждать о возможности развития выраженных побочных реакций на препарат, который применяют для лечения достаточно большого количества больных. Они должны быть точными, процент ложноположительных или отрицательных результатов должен быть минимальным. Необходимо, чтобы они были автоматизированными и достаточно простыми в применении, чтобы их могли выполнять в обычных клинических лабораториях. Для разработки диагностического теста необходимо идентифицировать соответствующий ген, детерминирующий реакцию организма на действие лекарственного средства. Затем следует провести клинические исследования с участием репрезентативных групп пациентов, чтобы определить, какие последовательности ДНК позволяют предсказать реакцию организма на данное лекарство. После чего необходимо разработать тест, который можно будет использовать в условиях клинических лабораторий.

По мере открытия новых генов и выяснения их свойств возможна разработка и таких тестов, которые одновременно будут определять реакцию организма на самые различные лекарственные препараты. Например, в будущем можно использовать ДНК-чипы, на которых будут расположены последовательности всех известных генов, определяющих типы реакции на различные лекарственные средства.

Использование фармакогеномики на практике

По оценкам специалистов новые лекарственные препараты, при применении которых в клинике будут учитывать индивидуальные реакции организма пациента, могут появиться через 3 года — 5 лет. Но сначала данные фармакогеномики будут использованы для повышения терапевтической эффективности и снижения риска развития побочных реакций в отношении тех лекарственных препаратов, которые уже используют в клинической практике. Например, один из пионеров в области фармакогеномики — французская компания «Genset» — предоставляет комплекс услуг в этой области. Она предлагает фармацевтическим компаниям: 1) проводить идентификацию маркеров и генов, ассоциированных с эффективностью и/или безопасностью лекарственного соединения, используемого в клинической практике или находящегося на стадии разработки; 2) предоставлять исключительные права на патенты открытий, сделанных в ходе проведения таких исследований; 3) переходить от программ по фармакогеномике к использованию генов, ассоциированных с развитием заболеваний, с целью иссле дования потенциальных «мишеней» для фармакологического воздействия, что позволит разработать лекарственное средство нового поколения. Для предупреждения побочных реакций «Genset» предлагает фармацевтическим компаниям свое участие в разработке лекарственных препаратов с учетом полиморфизма генов, обусловливающих особенности реакции на данный препарат у разных групп пациентов. Компания также может разрабатывать специальные скрининговые фармакогеномные тесты для выявления тех пациентов, у которых высок риск развития побочных реакций. Например, американская компания «Abbott Laboratories» разработала новый лекарственный препарат Zyflo® (цилейтон) для лечения больных бронхиальной астмой. Однако обнаружилось, что приблизительно у 3% пациентов он оказывает токсическое воздействие на печень. Поэтому компания «Abbott Laboratories» заключила в 1997 г. контракт с компанией «Genset» на сумму 22,5 млн долларов США о совместной разработке диагностического теста для генетического скрининга пациентов, которым противопоказано назначение препарата Zyflo®. Другой контракт «Genset» заключила в 1998 г. с компанией «Pharmacia & Upjohn». Согласно условиям соглашения, компания «Genset» предоставит свои фармакогеномные технологии для идентификации маркеров и генов, которые принимают участие в формировании реакции организма на воздействие одного из лекарственных веществ, разработанных компанией «Pharmacia & Upjohn».

Проблемы внедрения фармакогеномики

Под фармакогеномикой понимают одну из новых, динамично развивающихся наук, в отношении которой среди разных специалистов идут оживлённые споры и дискуссии. Одни считают, что в ней персонализированная медицина обретёт большое будущее, а другие относятся к ней критически несмотря на ряд серьёзных практических исследований, проведённых в данной области.

Известно: генетические вариации, выявляемые у пациента, позволяют выстроить взаимосвязь с его реакцией на лекарственные препараты. После исследований данные о связи гена и лекарственной реакции вводят в специализированные базы фармакогеномики. Нет сомнения в том, что такая информация является полезной как при создании лекарственных средств, так и при их назначении. В обиход современной медицины фармакогеномика, вследствие объективных причин, ещё не вошла, однако ценных примеров использования её результатов можно привести уже много.

Из истории развития науки

Зарождение фармакогеномики обеспечили:

фармакология, являющаяся наукой о том, какими бывают лекарственные средства и каким образом они действуют на организм;
геномика — наука об изучении генов и их функций. Основная задача геномики заключается в выявлении связи между признаками, которые наследуются в процессе формирования генофонда, и реакцией организма на получаемые лекарства.

Известно, что лекарственные реакции являются сугубо индивидуальными и зависят, в свою очередь, от наследственности. Их действие обусловлено:

фармакокинетикой. Она определяет, каким образом всасываются, распределяются, метаболизируются и выводятся организмом молекулы лекарств;
фармакодинамикой. Она определяет, каким образом изменяются молекулы, принимающие участие в механизмах воздействия на организм лекарственных препаратов.

Метод, заключающийся в поиске генетических признаков, оказывающих влияние на действие препаратов, получил названия фармакогеномного тестирования. Данные, получаемые с его помощью, выполняют две главные функции. Первая: практикующий врач корректно подбирает лекарства для больного и их оптимальные дозировки. Вторая: фармацевтические компании производят новые лекарственные средства, являющиеся более безопасными и клинически эффективными, чем прежние.

По-настоящему фармакогеномика как наука сформировалась в свете длительных наблюдений за тем, как по-разному реагируют больные на терапию лекарствами.

Во время второй мировой войны американские солдаты получают сильный препарат против малярии, который называется примахин. После приёма лекарства у многих начались проявления странного заболевания с симптомами высокой температуры, сильных болей в голове и области живота, а также анемии. Речь шла о фавизме — патологии, известной с древних времён и описанной ещё Пифагором. Интересным фактом является следующее: фавизм наблюдали только у солдат-африканцев, что позже заставило медиков серьёзно задуматься о его наследственном происхождении.

Сейчас уже известны истинные причины фавизма: дело в ферменте G6PD (глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа). Он кодирует это ферментное вещество, ответственное за сложные биохимические реакции. Именно от них зависит то, как в организме человека восстанавливается глутанион, который свою очередь, он является мощным природным антиоксидантом, что обеспечивает защиту клеток от окислительных процессов. Если у пациента на генетическом уровне сильно снижено количество фермента G6PD, защита нарушается, в результате чего возникает разрушение красных кровяных клеток — эритроцитов. На них начинают интенсивно действовать окислители, входящие в состав как пищи, так и лекарственных препаратов.

Далее медикам довелось регулярно наблюдать ряд важных различий в ответах пациентов на лекарственные препараты, благодаря чему они определили и поняли их наследственное происхождение. Например, в 50-е годы при проведении хирургических операций наряду с анестетиками применяли суксаметоний. Это миорелаксант, на который приблизительно у одного из двух с половиной тысяч больных возникали опасные побочные действия, связанные с пролонгацией его эффекта. Как результат — остановка дыхания с возможным параличом дыхательного центра в мозге. Такое состояние угрожало жизни пациентов: в их организме было недостаточно фермента псевдохолинэстеразы для того, чтобы нормально инактивировать суксаметоний.

В конце 50-х годов прошлого столетия врачом из Германии Ф. Фогелем было впервые введено понятие фармакогенетики. Таким образом, официально она родилась в 1959 году, а в 1962 году в свет вышло первое систематизированное учебное пособие по фармакогенетике, написанное В. Каловым.

Конец 50-годов ознаменовался накоплением результатов исследований, основанных на наблюдениях, что помогло фармакогенетике приобрести официальный статус научной дисциплины. Во второй половине 50-х годов А. Мотульский опубликовал важную работу о лекарственных реакциях, генетике и ферментах, обобщив в ней всю полученную информацию о том, каким образом наследственные факторы влияют на лекарственное лечение.

Бесплатная консультация по вопросам обучения

Наши консультанты всегда готовы рассказать о всех деталях!

Фармакогенетика как наука стала интенсивно развиваться благодаря открытию ряда важных ферментов с их способностью химической модификации лекарственных молекул. Эта модификация называется биотрансформацией или метаболизмом - природным процессом, обеспечивающим работу тех же механизмов, используемых для того, чтобы компоненты пищи усваивались нормальным образом.

Открытие главного фермента метаболизма приходится на те же 50-е годы прошлого столетия. Место открытия — фонд исследований Джонсона в Пенсильванском университете (США). М. Клинберг, один из биохимиков, экспериментируя с клетками крысиной печени, нашёл в них фермент, связывающий угарный газ. При анализе спектров нового вещества учёному удалось выявить пик поглощения с длиной волны 450 нанометров. Другие цитохромы давали абсолютно другие показатели.

Чуть позже это же вещество было изучено японскими учёными Ц. Омура и Р. Сато. Они выделили его из кроличьей печени, обнаружив в нём компонент, не содержащий белок — гем (как у гемоглобина). Далее с помощью эксперимента было установлено, что компонент связывает молекулу углекислого газа. Новое вещество назвали P450 или «пигментом 450».

В конечном итоге оказалось: CYP450 — это обширная группа ферментов, принимающих участие в метаболических процессах многих лекарственных средств. При этом группу CYP450 обнаружили практически во всех известных науке формах жизни: начиная от животных и заканчивая простейшими. Гены, кодирующие ферментные вещества группы CYP450, отличаются высоким полиморфизмом (разнообразием проявлений), что обуславливает разные уровни метаболизма лекарств. Именно это сильно влияет на эффект терапии.

Сейчас известными и ценными являются следующие факты о ферментах группы CYP450:

их насчитывают больше 50;
6 ферментов из этой группы метаболизируют примерно 90% известных лекарственных препаратов;
первым таким ферментом стал CYP2D6, открытый в 1977 году. Он является главным биотрансформирующим веществом и принимает участие в метаболизме более 20% лекарственных средств.

Вначале фармакогенетика могла изучать только отдельные вариации генов и то, как они обуславливают воздействие лекарств. С этим был связан ряд ограничений: ведь в ответной реакции организма на то или иное вещество участвуют несколько генов одновременно. Был необходим учёт совокупности именно общего влияния.

Проблему удалось решить, когда наступила так называемая «постгеномная эра». Полная информация человеческой ДНК была прочитана в ходе проекта «Геном человека» (2003 г.). В результате учёные создали не одну информационную базу, каждая из которых стала общедоступной. Впоследствии были разработаны и специализированные фармакогеномные базы с данными о генах, оказывающих влияние на лекарственную терапию.

Клинические исследования в ракурсе генотипирования

Для того, чтобы эффективно персонализировать лечение, учитывая наследственные факторы, необходимы знания о различиях людей на молекулярно-генетическом уровне. Речь идёт об изменениях в ДНК-фрагментах, отвечающих за кодирование белков. Эти белковые структуры вступают во взаимодействие с лекарственными молекулами.

Хромосомы — носители информации о наследственности в клетках. Они являются сложнейшими молекулярными образованиями. В состав хромосом входят:

Функция ДНК заключается в хранении и передаче наследственной информации в виде нуклеотидных цепочек. Нуклеотиды — полимеры, состоящие из нескольких компонентов:

дезоксирибоза (остаточный сахар);
фосфорная кислота;
азотистое основание из возможных 4-х (гуанин, аденин, тимин или цитозин).

Согласно определённым нуклеотидным последовательностям (ими являются гены), в них имеется информация о том, в каком порядке выстроены аминокислоты в белках. Принцип, составляющий такую последовательность, получил название генетического кода.

В составе человеческого генома находится приблизительно от 20 до 22 000 генов. При этом число нуклеотидных сочетаний огромно. В человеческом геноме насчитывают несколько миллионов различных аллелей (версий генов). Именно эта разница обеспечивает многовариантность аминокислотных последовательностей белков, от которых зависят функция и структура генов.

Если понимать аллели в широком смысле, они являются любыми альтернативными вариантами генов. Когда они распространены в человеческой популяции, принято говорить о множественном аллелизме. Это не что иное как изменчивость, благодаря которой генофонд отличается огромным разнообразием.

Генетические вариации многообразны, а классифицировать их до сих пор непросто. Например, мутации точечного характера и снипы встречаются часто. Снипы нормальны, а мутации негативно влияют на репродукцию, способность организма к жизни и состояние его здоровья. И те, и другие имеют идентичную структуру, а отличия между ними можно найти, учитывая длительный эволюционный процесс. Естественный отбор обусловил закрепление аллелей-снипов как наиболее подходящих для выживания. Мутации меньше распространены, так как естественный отбор их попросту выбраковывает.

Фармакогеномика имеет собственные обозначения изменений в генах, которые определяют ответы на введение в организм лекарственных препаратов.

Что касается методов генотипирования, их применяют несколько. Для того, чтобы выявить снипы-аллели, специалисты проводят размножение гена, используя ПЦР. Далее они идентифицируют его вариации, которые уже известны. Применение такого подхода типично для обычной практики, так как он доступен и не отличается высокими затратами на проводимые исследования.

Ещё один способ генотипирования — использование микрочипов ДНК. Он позволяет выявить несколько маркеров фармакогеномики одновременно. Микрочипы содержат в своём составе последовательности ДНК в огромных количествах: их могут быть сотни тысяч. В лабораторных условиях материал фиксируют к кремниевой или стеклянной матрице. Благодаря гибридизации, в процессе которой биологические молекулы ДНК связываются с короткими последовательностями, можно сразу выявить десятки изменений в генетике.

Полигеномный поиск ассоциаций (по-английски GWAS) основан на применении микрочипов ДНК. Таким образом специалисты проводят идентификацию снипов сотнями тысяч и даже миллионами в разных группах. После этого нужно сравнить все полученные данные с целью выявления верной корреляции между генетикой и реакцией на лекарства. Методика GWAS нашла широкое применение в области геномных исследований, но её использование сильно ограничено ввиду специфики самого исследования и людей, входящих в разные группы.

Технологии NGS (или высокопроизводительное секвенирование нового поколения) предназначены для того, чтобы анализировать геномную информацию в больших объёмах. Так можно провести идентификацию снипов более точно, в том числе и их редкие полиморфические виды. Кроме того, с помощью метода NGS определяют крупные изменения в структуре генома. Поскольку разрешающая способность NGS становится всё более высокой, а сам способ дешевле, можно говорить о перспективном и популярном методе.

Последние достижения отрасли

Фармакогеномика динамично развивается из года в год. Особенно её методы находят применение в кардиологической и онкологической практике.

В последнее время учёным удалось раскрыть многие наследственные аспекты, влияющие на процесс кардиотерапии. Сейчас с успехом применяют кардиогеномные тесты, благодаря которым прогнозируют, как действуют внутри организма клопидогрел и варфарин. Речь идёт об антитромбических агентах: для них ещё в 2011 г. консорциумом CPIC, занимающимся вопросами практического внедрения фармакогенетики, было опубликовано подробное руководство о том, как следует применять генетическое тестирование.

В онкологической практике главное — правильно подобрать препарат и его дозировку. Часто это вопрос жизни и смерти для пациента: если терапия назначена и проведена некорректно, возникают серьёзные осложнения либо лечебный эффект отсутствует вообще. Важность персонализированного подхода здесь огромна, так как речь идёт о множественных нарушениях генетической структуры клеток. В сумме эти нарушения определяют дальнейшее течение процесса.

Когда говорят о злокачественном процессе, под ним подразумевают ряд соматических мутаций. Мутагенные изменения возникают на клеточном уровне и характеризуются системными нарушениями сигнальных путей. В свою очередь, сигнальные пути отвечают за запуск клеточных делений. Один из ярких примеров подобных нарушений — мутация BRAF. Она приводит к развитию кожной меланомы. Если BRAF ингибирует вемурафиниб, патолоические сигналы можно редуцировать или попросту отключить, предотвратив злокачественное перерождение клеток. Аналогичный способ воздействия и у иных лекарственных средств, являющихся таргетной терапией.

Большая часть клеток постоянно делится, обеспечивая передачу соматогенных мутаций всем клеткам, которые произошли от начальной. Тем не менее, ряд поколений эти мутации не наследует. Если в ходе фармакогеномических исследований учитывать врождённые и соматические изменения в генах, можно повысить эффективность противораковой терапии. При этом соматические изменения имеют большое значение в плане успеха лечения, а зная о врождённых аномалиях, врачи могут выявить больных, у которых имеется высокий риск развития серьёзных и опасных осложнений.

Поскольку фармакогеномику относят к молодым научным направлениям, в сфере психиатрии она пока не получила должного развития. Это понятно: сама психофармакология является слишком молодой и малоизученной сферой. Её развитие вкупе с использованием первых лекарственных препаратов в психиатрической практике пришлось как раз на 50-е годы прошлого столетия, когда фармакогенетика только начинала зарождаться. Также и психиатрия как предмет является одним из самых трудных для изучения, так как области поведения и психики связаны со многими факторами и находятся от них в большой зависимости. Одна и та же болезнь может быть подвержена влиянию нескольких генов одновременно, поэтому провести корректную связь между биомаркерами и патологиями непросто.

Однако достижения фармакогеномики в психиатрии всё же есть. Прежде всего, они связаны с использованием лекарственного средства карбамазепина при лечении больных эпилепсией. Карбамазепин — препарат, обладающий серьёзным побочным действием. Это системная аллергическая реакция, которую называют синдромом Стивенса-Джонсона. Она возникает у пациентов, имеющих определённые генетические аллели, что очень важно для ответа иммунитета. Эти генетические аллели обеспечивают кодирование ряда белков основного гистосовместимого комплекса. Белки находятся на клеточных поверхностях, создавая связи между чужеродными частицами и направляя их к Т-лимфоцитам. Таким образом происходит запуск иммунного ответа.

Проблематика и перспективы исследований

Фармакогеномика сейчас является преимущественно экспериментальным направлением, но поскольку многие специалисты приветствуют развитие персональной медицины, применение фармакогеномических методов станет шире как в практике врачей-клиницистов, так и при создании новейших лекарственных препаратов. Благодаря упреждающему генетическому тестированию становятся возможным прогнозы о том, какие виды препаратов будут обладать максимальной эффективностью ещё до того, как начнётся курс лечения.

Некоторые лекарства уже постоянно тестируют специалисты, давая надежду на большое будущее фармакогеномики. Есть даже мнение, что в скором времени она войдёт в медицинскую стандартизацию и будет способствовать улучшению показателей терапии различных патологий.

Тем не менее, существует и ряд очевидных проблем, которые предстоит решать. Например, ранние фармакогеномические исследования были сконцентрированы на генах, которые меняют лекарственную фармакокинетику. Это заложило определённую основу, задав дисциплине направление, но когда пришла постгеномная эра, решающее влияние огромного количества генов стало более чем понятным. Именно оно определяет как степень эффективности лечения лекарственными препаратами, так и ответную реакцию организма на них. Все эти факторы значительно осложняют процесс анализа и последующей интерпретации полученных сведений тестирования. Далеко не всегда ясны количество и типы генов, влияющих на степень лекарственного ответа.

Более того, если внедрять предварительное фармакогеномное тестирование, понадобится веское подтверждение его очевидных плюсов перед классическими лекарственными назначениями, когда генетическая информация о пациентах не учитывается. Сбор таких доказательств непрост. Особенно проблематично и порой нереально собрать практические доказательства того, что терапия, назначаемая таким образом, и эффективна, и безопасна одновременно.

Если собирать такие доказательства, нужны специальные исследования. Они требуют много человеческих ресурсов и финансовых средств. Ситуация осложняется и рядом ограничений, накладываемых на способы исследований, которые далеко не всегда точны. К примеру, для проведения полноценного GWAS нужно привлекать сотни и тысячи разных людей. Это участники как контрольных, так и исследуемых групп, необходимых для того, чтобы добиться искомых размеров выборки. При этом выборки, сравниваемый между собой, должны обладать некоторой однородностью (пол, возраст, национальность и проч.). К сожалению, это часто не представляется возможным.

Таким образом, практическое применение знаний, накопленных фармакогеномикой, сильно опаздывает и в ближайшее время не сможет быть внедрённым в общие медицинские стандарты. В заключение стоит упомянуть и о самой дорогостоящей фазе любых клинических исследований, которая также требует участия тысяч людей. Ясно, что перед инвестированием огромных денег фармакомпании должны иметь твёрдую уверенность в последующем успешном внедрении нового препарата.

Фармакогеномика — молодая наука, которую следует рассматривать в качестве одной из возможных альтернатив. Оптимальный вариант заключается в использовании классических методов лекарственного назначения вкупе с опытом, накопленным в этой сфере.

"Геном человека" - последние достижения и прогноз

В апреле нынешнего года в Ванкувере состоялась Всемирная конференция "Геном человека", где обсуждали состояние работ по международному проекту и прозвучали прогнозы на ближайшие 40 лет. Доктор биологических наук Н.К.Янковский (Институт общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН) дает краткий обзор для наших читателей.

Уже через два месяца американские ученые планируют завершить черновик полного текста человеческой ДНК, который состоит из 3 млрд. букв – пар нуклеотидов. Черновик допускает определенное количество ошибок и белых пятен в тексте. "Символично, что это произойдет именно в нынешнем, 2000-м году, – говорит Николай Казимирович, – когда исполняется 100 лет открытию Менделем фундаментальных законов наследственности". К 2003 году будет опубликован окончательный текст генома. В этом варианте допускается уже не более одной ошибки на 10 тысяч позиций. "Кстати, 2003 год также будет юбилейным – исполнится 50 лет открытию Уотсоном и Криком двойной спирали ДНК", – напоминает ученый.

Еще несколько лет назад казалось невозможным расшифровать человеческий геном. Однако уже в 1998 году пришел большой успех – удалось секвенировать геном круглого червя – нематоды C. elegans. Это был первый многоклеточный организм, за который взялись ученые после бактерий и дрожжей. ДНК нематоды состоит из 97 пар нуклеотидов, что примерно в 30 раз меньше, чем у человека. Однако именно эта работа убедила скептиков, что расшифровка генома человека возможна, причем уже в ближайшее время.

Секвенирование последовательностей нуклеотидов происходит гигантскими темпами, в эту работу вовлечено огромное количество ученых, работающих как в государственных научных центрах, так и в частных фирмах. Только одна американская фирма "Celera", возглавляемая Г.Вентером, расшифровывает не менее 10 млн. нуклеотидных пар в сутки. Информация о геноме человека открыта и доступна для ученых всего мира. По международному соглашению в этой работе нет приоритета конкретных авторов – результаты принадлежат всему человечеству. Это уникальный пример сотрудничества ученых для достижения действительно эпохальной цели.

Итак, расшифровка ДНК, создание генетической карты человека, первая задача ученых, работающих по проекту генома человека. Вторая – разбить эту карту на отдельные гены, которых у человека насчитывается более 80 тысяч. Третья задача, над которой работают исследователи, – функциональный анализ генома. Нужно определить, как работают те или иные гены в разных клетках и тканях организма, в разные периоды его жизни.

Наиболее важный практический выход наших знаний о геноме человека – это молекулярная медицина, то есть генная диагностика болезней, их профилактика и генотерапия. Благодаря молекулярной медицине в будущем, вероятно, будут созданы новые лекарства, гораздо более избирательные и эффективные, чем ныне существующие, поскольку они будут целенаправленно действовать на генные и белковые мишени.

Параллельно с геномом человека идет расшифровка еще 820 геномов других животных и растений. Каким бы уникальным ни казался человек, в его ДНК есть довольно много сходства даже с мышами и дрозофилами. Что же касается наших ближайших родствен ников, то геном человека отличается от шимпанзе всего лишь на 1 % (!). Различия обнаружены в другом: в геноме человека много вставленных в него чужеродных элементов – ретровирусов, а у обезьян их почти нет. Сходство на генном уровне позволяет изучать работу какого-либо гена у более простых организмов – так проще и быстрее, а затем использовать эти результаты применительно к человеку.

В то же время каждый человек обладает уникальным геномом: мы отличаемся друг от друга приблизительно одной позицией нуклеотидов из тыся чи. Изучение генотипического разнообразия может дать ключ к пониманию уникальности личности, роли наследственности в интеллектуальных способностях и чертах характера. В обозримом будущем станет возможным создание генетического паспорта каждого человека.

Что можно ждать от геномных иссле дований в ближайшие 40 лет? Вот как сформулировал прогноз Ф.Коллинз, руководитель программы "Геном человека" (США).

Генетическое тестирование, профилактические меры, снижающие риск заболеваний, и генная терапия до 25 наследственных заболеваний. Медсестры начинают выполнять медико-генетические процедуры.
Широко доступна преимплантационная диагностика, яростно обсуждаются ограничения в применении данного метода.
В США приняты законы для предотвращения генетической дискриминации и соблюдения конфиденциальности.
Не всем доступны практические приложения геномики, особенно в развивающихся странах.

На рынке появляются лекарства от диабета, гипертонии и других заболеваний, разработанные на основе геномной информации.
Терапия рака, прицельно направлен ная на свойства раковых клеток.
Фармакогеномика становится общепринятым подходом для создания многих лекарств. Изменение способа диагностики психических заболеваний, появление новых способов их лечения, изменение отношения общества к таким заболеваниям.
Демонстрация безопасности генотерапии на уровне зародышевых клеток при помощи технологии гомологичной рекомбинации.

Определение последовательности нуклеотидов всего генома отдельного индивида станет обычной процедурой, стоимость которой менее 1000 $.
Каталогизированы гены, участвующие в процессе старения.
Проводятся клинические испытания по увеличению максимальной продолжительности жизни человека.
Лабораторные эксперименты на человеческих клетках заменены экспериментами на компьютерных моделях.
Активизируются массовые движения противников передовых технологий в США и других странах.

Все общепринятые меры здравоохранения основаны на геномике.
Определяется предрасположенность к большинству заболеваний (при/до рождения).
Доступна эффективная профилактическая медицина с учетом особенностей индивида. Болезни детектируются на ранних стадиях путем молекулярного мониторинга.
Для большинства заболеваний доступна генная терапия.
Замена лекарств продуктами генов, вырабатываемыми организмом при ответе на терапию. Средняя продолжительность жизни достигнет 90 лет благодаря социоэкономическим мерам. Проходят серьезные дебаты о воз можности человека контролировать собственную эволюцию.
Неравенство в мире сохраняется, создавая напряженность на международном уровне.

Эффективность и фармакогеномика химиотерапии Salvage CLAG-M у пациентов с рецидивом / рефрактерным и вторичным острым миелоидным лейкозом

Это проспективное клиническое исследование фазы II, которое будет проведено в Медицинском колледже г. Висконсин. После соответствия критериям исследования и включения в исследование пациенты будут получать лечение Химиотерапия кладрибином, цитарабином, митоксантроном, G-CSF (CLAG-M) с периодическим наблюдением. интервалы для определения основных и второстепенных задач.

Оптимальная схема лечения рецидивирующего / рефрактерного острого миелоидного лейкоза (ОМЛ): неизвестно. Хотя доступно несколько вариантов химиотерапии, универсального принятый режим на сегодняшний день. Одним из таких режимов является CLAG-M (кладрибин, цитарабин, митоксантрон, G-CSF), который часто используется в нашем центре. Однако трудно предсказать, какие пациенты, вероятно, будут реагировать на CLAG-M или испытывать токсичность, связанную с лечением. В у пациентов с впервые диагностированным ОМЛ исследования показали, что достижение минимальных отрицательный CR по остаточному заболеванию связан с лучшей общей выживаемостью. Однако это не были четко изучены у пациентов с рецидивирующим ОМЛ. В рамках этого исследования мы стремимся продемонстрировать влияние достижения отрицательного результата по МОБ на выживаемость пациентов с рецидивирующий / рефрактерный ОМЛ, получавший CLAG-M. В дополнение к традиционно используемым прогностических факторов, мы стремимся включить фармакогеномику для оценки эффективности и токсичность терапии.

Определить частоту полной ремиссии (ПО) и достижение минимальной остаточной болезни (MRD) негативность после лечения с использованием схемы химиотерапии Salvage CLAG-M у пациентов с рецидив / рефрактерный и вторичный ОМЛ.

1. Определить выживаемость без прогрессирования (ВБП) и общую выживаемость (ОС) пациентов. проходил курс химиотерапии CLAG-M.

2. Изучить фармакогеномику пациентов, получающих химиотерапию CLAG-M, и определить его влияние на выживаемость, частоту полного ответа и отрицательность МОБ.

3. Определение факторов, связанных с заболеванием или пациентом, которые прогнозируют отрицательность МОБ и выживание с CLAG-M.

Тип вмешательства: Препарат, средство, медикамент

Описание: Пациентам будет назначен режим CLAG-M, который состоит из следующего: Кладрибин 5 мг / м2 внутривенно более двух часов в дни 1-5; Цитарабин 2 г / м2 внутривенно в течение четырех часов в дни 1-5, начиная через два часа после завершения инфузии кладрибина; Митоксантрон 10 мг / м2 внутривенно в дни 1-3; Г-КСФ в дозе 300 мкг на 0-5 дни.

Этикетка Arm Group: Режим CLAG-M

1. Возраст ≥18 лет на момент получения информированного согласия.

2. Морфологически подтвержденный первичный острый миелоидный лейкоз (ОМЛ) или ОМЛ, вторичный по отношению к Миелодиспластический синдром (МДС) или связанный с лечением ОМЛ (т-ОМЛ), согласно определению World Критерии Организации здравоохранения (ВОЗ).

3. Пациенты должны соответствовать одному из следующих критериев:

- При первом или последующем рецидиве или рефрактерном статусе, с предшествующим или без него трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК) ИЛИ

- Пациенты с МДС, преобразованным в ОМЛ, будут иметь право на участие, даже если они не прошли ранее получал терапию по поводу ОМЛ.

4. Оценка результативности Восточной совместной онкологической группы (ECOG) 0-2.

5. Пациенты должны соответствовать следующим клиническим лабораторным критериям: Прямой билирубин ≤ 1,5. X верхний предел нормального диапазона (ULN), аланинаминотрансфераза (ALT) и аспартатаминотрансфераза (АСТ) ≤ 3 × ВГН, если не связано с ОМЛ или синдромом Жильбера или гемолиз. Расчетный клиренс креатинина ≥30 мл / мин.

6. Фракция выброса левого желудочка (ФВЛЖ) ≥ 45%.

1. Острый промиелоцитарный лейкоз.

2. Беременные или кормящие женщины.

3. Участие в клинических испытаниях с другими исследуемыми агентами, не включенными в это испытание, в течение 14 дней с начала этого испытания и в течение всего срока это испытание.

Читайте также: