Поляризационная микроскопия. Интерференционная микроскопия. Люминесцентная микроскопия. Техника микроскопии.
Обновлено: 25.06.2024
Люминесцентная микроскопия — это фиксация при помощи микроскопа первичного либо вторичного люминесцентного свечения объектов.
Принцип люминесцентной микроскопии
Довольно большое количество веществ биологического происхождения имеют такую способность, как свечение, при воздействии на них света.
Такое свечение формируется по причине того, что объекты поглощают лучистую энергию, которая попадает на их поверхности. Длина волны при люминесценции больше, чем у поглощенного света.
Чем люминесцентный микроскоп отличается от обычного светового микроскопа?
Строение светового микроскопа отличается от люминесцентного. Дело в том, что люминесцентный микроскоп оснащен специальной осветительной системой, которая излучает свет, вызывающий соответствующее свечение объектов.
Провоцировать подобное свечение объектов рекомендуется либо ультрафиолетом, либо сине-фиолетовыми лучами. Таким образом можно получить цветное изображение.
Используются разновидности ламп, как, например, ртутно-кварцевая или галогенная кварцевая лампа. Ими оснащается все флуоресцентный микроскоп, они излучают свет в синем спектре.
Также используются специальные светофильтры, которые пропускают только ту часть света, которая способна возбудить люминесцентное свечение объекта. Также используются теплофильтры, которые противостоят перегреву остальных фильтров, оптической конструкции и самого исследуемого объекта.
Есть и объекты, которые не обладают люминесцентным свечением. Однако, это не проблема. Ведь есть возможность обработки их флюорохромами, специальными веществами, которые могут поглощать свет и являются люминесцентными.
Именно по этому принципу люминесценцию разделяют на первичную и вторичную, соответственно, первичной называется та люминесценция, которой объекты обладают без какого-либо внедрения, а вторичной - при окрашивании их флюорохромами.
Применение люминесцентной микроскопии позволяет увеличить контрастность объекта, в микробиологии именно такая методика позволяет отчетливо рассмотреть органеллы и другие клеточные структуры.
Довольно большое значение имеет реакция иммунофлюоресценции в вирусологии, так как при помощи данной технологии меченные флюорохромом антитела идентифицируют антигены чужеродных организмов. Такая технология может значительно помочь в экспресс- идентификации вирусных заболеваний.
Люминесцентная микроскопия имеет широкое распространения в современной науке и технике.
Поляризационная микроскопия позволяет получать изображения неокрашенных анизотропных структур (например, коллагеновых волокон, миофибрилл или клеток микроорганизмов). Принцип метода основан на изучении объекта в свете, образованном двумя лучами, поляризованными во взаимно перпендикулярных плоскостях.
Рис. 11-4. Схема люминесцентного микроскопа.
Интерференционная микроскопия
Интерференционная микроскопия объединяет принципы фазово-контрастной и поляризационной микроскопии. Метод применяют для получения контрастного трёхмерного изображения неокрашенных объектов. Принцип метода основан на раздвоении светового потока в микроскопе; один луч проходит через объект, другой — мимо него. Оба луча соединяются в окуляре и интерферируют между собой.
Рис. 11-5. Прямая иммунофлюоресценция. Прямой метод предполагает использование помеченных флюоресцирующим красителем AT к интересующему Аг; AT взаимодействуют с Аг в местах их локализации, что и позволяет визуализировать метка.
Люминесцентная микроскопия
Метод люминесцентной микроскопии основан на способности некоторых веществ светиться при воздействии коротковолнового излучения. При этом испускаемые световые волны длиннее волны, вызывающей свечение. Иными словами, флюоресцирующие объекты поглощают свет одной длины волны и излучают в другой области спектра (рис. 11-4). Например, если индуцирующее излучение синее, то образующееся свечение может быть красным или жёлтым. Эти вещества (флюоресцеин изоцианат, акридиновый оранжевый, родамин и др.) используют как флюоресцирующие красители для наблюдения флюоресцирующих (люминес-цирующих) объектов. В люминесцентном микроскопе свет от источника (ртутная лампа сверхвысокого давления) проходит через два фильтра.
Рис. 11-6. Непрямая иммунофлюоресценция. Непрямой метод предполагает использование двух различных AT. Первые AT реагируют с Аг микроорганизма, вторые AT (связанные с меткой) специфически взаимодействуют с первыми AT, являющимися Аг ко вторым AT. Метод значительно чувствительнее, чем прямая иммунофлюоресценция, так как с каждой молекулой первых AT связывается несколько молекул вторых AT.
Первый (синий) фильтр задерживает свет перед образцом и пропускает свет длины волны, возбуждающей флюоресценцию образца. Второй (жёлтый) задерживает синий свет, но пропускает жёлтый, красный, зелёный свет, излучаемый флюоресцирующим объектом и воспринимаемый глазом. Обычно исследуемые микроорганизмы окрашивают непосредственно либо с помощью AT или лектинов, помеченных флюоро-хромами. Препараты взаимодействуют с Аг или другими связывающими лиганд структурами объекта. Люминесцентная микроскопия нашла широкое применение для визуализации результатов иммунохимических реакций, основанных на специфическом взаимодействии меченных флюоресцирующими красителями AT с Аг изучаемого объекта. Варианты иммунофлюоресцентных реакций представлены на рис. 11-5 и 11-6.
Информация на сайте подлежит консультации лечащим врачом и не заменяет очной консультации с ним.
См. подробнее в пользовательском соглашении.
Обзор
Авторы
Редакторы
Один из старейших научных приборов — микроскоп — появился практически одновременно с наукой в ее современном виде. Этот канонический инструмент биолога более 400 лет был важнейшим средством для познания живого, и дал львиную долю наших знаний об устройстве жизни. Все это время эволюция микроскопа продолжалась, расширяя возможности увидеть неразличимое глазом.
12 биологических методов в картинках
Генеральный партнер цикла — компания «Диаэм»: крупнейший поставщик оборудования, реагентов и расходных материалов для биологических исследований и производств.
Одна из главных миссий «Биомолекулы» — докопаться до самых корней. Мы не просто рассказываем, какие новые факты обнаружили исследователи — мы говорим о том, как они их обнаружили, стараемся объяснить принципы биологических методик. Как вытащить ген из одного организма и вставить в другой? Как проследить в огромной клетке за судьбой нескольких крошечных молекул? Как возбудить одну крохотную группу нейронов в огромном мозге?
И вот мы решили рассказать о лабораторных методах более системно, собрать воедино в одной рубрике самые главные, самые современные биологические методики. Чтоб было интереснее и нагляднее, мы густо проиллюстрировали статьи и даже кое-где добавили анимации. Мы хотим, чтобы статьи новой рубрики были интересны и понятны даже случайному прохожему. И с другой стороны — чтобы они были так подробны, что даже профессионал мог бы обнаружить в них что-то новое. Мы собрали методики в 12 больших групп и собираемся сделать на их основе биометодический календарь. Ждите обновлений!
История микроскопии
На пороге микромира
Собирающие (увеличивающие) линзы были известны с XI века, и очки распространились по Европе уже в XIV веке. Традиционно изобретение первого составного микроскопа приписывают отцу и сыну — Хансу и Захарию Янсенам в 1595 году (рис. 1). Этот первый микроскоп мог увеличивать изображение всего в 3-9 раз. Есть версия, что первый микроскоп создал Корнелиус Дреббель. Среди изобретателей первых микроскопов был и Галилей, создавший свой микроскоп в 1609 году. Так или иначе, ни один из изобретателей не оставил подробных описаний микромира. Микроскопия как наука началась с Роберта Гука, который в 1665 году издал Micrographia — книгу, в которой подробно описывались устройство микроскопа, основы оптики и первые наблюдения за биологическими объектами, иллюстрированные подробными рисунками [1]. Микроскоп Гука (рис. 2) состоял из трех линз и источника света — эта основа сохраняется и в современной микроскопии. Однако достичь больших увеличений удалось с помощью более простой конструкции — Антони ван Левенгук использовал, казалось бы, примитивный микроскоп всего с одной линзой (рис. 2). Однако благодаря высочайшему качеству этой линзы ему удалось достичь 200-кратного увеличения и описать клетки простейших и даже крупные бактерии. Использование всего одной линзы не создавало оптических аберраций, которые только множились при конструировании более сложной оптической системы.
Генеральный партнер цикла «12 методов» — компания «Диаэм»
«Диаэм» — крупнейшая российская компания, специализирующаяся на поставке оборудования и реагентов ведущих мировых производителей в области микроскопии: от микроскопов начального уровня до исследовательских, конфокальных и мультифотонных систем, а также автоматизированных биоимиджинговых систем, способных поддерживать жизнеспособность клеток при постановке длительных экспериментов.
Материал предоставлен партнёром — компанией «Диаэм»
Рисунок 1. Микроскопия: этапы большого пути. 1590 г. — Захарий и Ханс Янсены создают первый микроскоп. 1665 г. — первое издание книги Роберта Гука Micrographia: описание и иллюстрации первых микроскопических исследований. 1674 г. — Антони ван Левенгук с помощью своего микроскопа описывает инфузории, а в дальнейшем — бактерии, сперматозоиды, вакуоли внутри клетки и т.п. 1858 г. — Йозеф фон Герлах разрабатывает окрашивание кармином — одной из первых гистологических красок. 1878 г. — Эрнст Аббе выводит формулу Аббе, позволяющую вычислить максимальное разрешение, исходя из длины волны. 1911 г. — Оскар Хеймштадт изобретает первый флуоресцентный микроскоп. 1929 г. — Филипп Эллингер и Август Хирт конструируют эпифлуоресцентный микроскоп, в котором эффективно отфильтровывалось излучение от источника света. 1932 г. — Фриц Цернике изобретает фазовый контраст, позволяя рассматривать живые неокрашенные объекты с большим контрастом. 1933 г. — Эрнст Руска совместно с Максом Кноллем создает первый электронный микроскоп. В 1939 году с его помощью выпустили первый коммерческий электронный микроскоп. 1934 г. — Джон Маррак получает первый конъюгат антитела с красителем. Первое практическое использование Альбертом Кунсом, усовершенствовавшим технику конъюгацией с флуоресцентной меткой. 1942 г. — Эрнст Руска создает сканирующий электронный микроскоп. 1962 г. — первое описание GFP Осамой Симомурой. 1967 г. — первое использование конфокальной микроскопии Моймиром Петраном, Дэвидом Эггером и Робертом Галамбосом. 1969 и 1971 гг. — первое описание конфокальной лазерной микроскопии. 1981 г. — Герд Бинниг и Генрих Рорер создают первый сканирующий туннельный микроскоп. 1986 г. — Герд Бинниг, Келвин Куэйт и Кристофер Гербер изобретают атомно-силовую микроскопию. 1990 г. — Винфрид Денки и Джеймс Стиклер разрабатывают первый двухфотонный микроскоп. 1994 г. — Штефан Хелл: суперразрешающая электронная микроскопия на основе подавления спонтанного испускания (STED). 2006 г. — изобретение PALM/STROM-микроскопии. Чтобы увидеть рисунок в полном размере, нажмите на него.
Рисунок 2а. Первые «ласточки». Микроскоп Гука (реконструкция).
Читайте также: