Маркеры пролиферации клеток. Смешенные маркеры клеток.

Обновлено: 18.05.2024

Внепеченочные проявления HCV-инфекции, к которым относится смешанная криоглобулинемия (КГ), имеют важное значение для оценки прогноза и определения тактики лечения этих пациентов. В настоящее время смешанную КГ II типа рассматривают как специфический маркер хронической HCV-инфекции. Поражение почек является одним из тяжелых и нередко определяющих прогноз внепеченочных проявлений HCV-ассоциированного криоглобулинемического васкулита. В обзоре обсуждаются современные возможности диагностики криоглобулинемического гломерулонефрита, а также перспективы, связанные с совершенствованием противовирусной и патогенетической терапии.

Ключевые слова

Полный текст

ГН - гломерулонефрит ИНФ-α - интерферон-α КГ - криоглобулинемия МКГН - мезангиокапиллярный гломерулонефрит МПГН - мембранопролиферативный гломерулонефрит ПАФ -- плазмаферез ПВТ - противовирусная терапия ПегИНФ-α - пегилированный интерферон-α ПКО - полный клинический ответ ПППД - препараты прямого противовирусного действия РФ - ревматоидный фактор УВО - устойчивый вирусологический ответ ФСГС - фокально-сегментарный гломерулосклероз ХГС - хронический гепатит С ЧКО - частичный клинический ответ BLyS - стимулятор В-лимфоцитов HCV - вирус гепатита С Термин криоглобулинемия (КГ) известен с середины ХХ в., когда V. Lerner и G. Watson (1948) установили, что свойство сыворотки крови обратимо преципитировать при температуре ниже 37 °С зависит от наличия в ней иммуноглобулинов [1]. Клиническое значение КГ впервые отметил M. Meltzer, описавший в 1966 г. «эссенциальную» смешанную криоглобулинемию из иммуноглобулинов разных изотипов, которая ассоциировалась с тремя клиническими симптомами - пурпурой, артралгиями и слабостью, впоследствии обозначенными как триада Мельтцера с возможным присоединением гломерулонефрита [2]. В 1974 г. J.C. Brout и соавт. предложили разделение криоглобулинемии на три типа в зависимости от компонентов криопреципитата. Согласно этой классификации типы II и III относятся к смешанной КГ и состоят из антигена - обычно поликлонального IgG и анти-IgG - моноклонального IgMκ (тип II) или поликлонального IgM (тип III) со свойствами ревматоидного фактора (РФ) [3]. После идентификации в 1989 г. вируса гепатита С (HCV) практически сразу была отмечена связь смешанной КГ с HCV-инфекцией, что послужило поводом для новой волны интереса к проблеме КГ и повлекло за собой кардинальные изменения в ее изучении. В настоящее время смешанную КГ II типа рассматривают как специфический маркер хронической HCV-инфекции, о чем свидетельствует обнаружение HCV-инфекции у 80-95% больных со смешанной КГ (II типа) и выявление криоглобулинов в сыворотке крови / криопреципитатах примерно у половины больных хроническим гепатитом С (ХГС), причем оказалось, что концентрация HCV RNA в криопреципитатах в десятки тысяч раз превосходит ее концентрацию в сыворотке 6. Участие HCV в развитии КГ и криоглобулинемического синдрома подтверждается наличием HCV в иммунных комплексах (HCVIgG - IgMκРФ) и обнаружением антигенов вируса и HCV РНК методом гибридизации in situ в поврежденных тканях [7, 8]. Нами проведено исследование частоты смешанной КГ в группе из 130 больных гепатологического отделения многопрофильного стационара с установленным диагнозом ХГС: КГ выявлена в сыворотке крови у 37% больных [9]. Полученные нами данные практически не отличаются от приводимых в литературе: частота КГ среди лиц, инфицированных HCV, в Европе оценивается в диапазоне от 34% в Италии до 54% во Франции [8]. Патогенез клинически значимого криоглобулинемического синдрома, наблюдающегося у 30% больных, рассматривают с позиции лимфотропности HCV. Результатом взаимодействия антигенов вируса со специфическими рецепторами на поверхности В-лимфоцитов (установлено взаимодействие E2 HCV с CD81 В-лимфоцитов) является поли/олиго/моноклональная пролиферация В-лимфоцитов с повышенной продукцией широкого спектра аутоантител. Образованные иммунные комплексы, в том числе смешанные криоглобулины, создают субстрат иммунопатологических реакций, которые лежат в основе клинических проявлений КГ. У части больных длительная активация В-лимфоцитов с накоплением генетических изменений ведет к развитию злокачественной В-клеточной пролиферации [7, 8, 10]. Клинический симптомокомплекс, ассоциированный с криоглобулинемическим васкулитом, включает кожный васкулит (сосудистая пурпура), вовлечение суставов (артралгии, артриты), в том числе в составе классической триады Мельтцера (пурпура, артралгии и слабость), кроме того, поражение слюнных желез, периферической нервной системы (сенсорная или сенсорно-моторная полиневропатия), почек (криоглобулинемический мезангиокапиллярный гломерулонефрит - ГН). Реже развивается легочный васкулит или фиброзирующий альвеолит, поражение сосудов желудочно-кишечного тракта, головного мозга, коронарных сосудов [8, 11, 12]. У больных с HCV-инфекцией без КГ также возможно развитие системных проявлений, однако при наличии КГ их частота выше, а спектр - шире. Больные с КГ характеризуются и значимо большей частотой выявления иммунных нарушений: повышения активности РФ (у 84,4% против 24,2%), уровня IgМ (у 68,8% против 20,9%), снижения гемолитической активности комплемента (у 92,2% против 29%) [11]. Среди спектра системных проявлений хронической HCV-инфекции поражение почек нередко определяет прогноз [6, 9, 11]. В ассоциации с инфекцией вируса гепатита С описано несколько форм ГН: криоглобулинемический и некриоглобулинемический мезангиокапиллярный/мембранопролиферативный (МКГН/МПГН), диффузный пролиферативно- экссудативный ГН, мембранозный ГН. Имеются отдельные наблюдения у лиц, инфицированных вирусом гепатита С, нефрита с минимальными изменениями, фокально-сегментарного гломерулосклероза (ФСГС), IgA-нефропатии и таких более редких форм, как фибриллярный и иммунотактоидный, однако причинная связь этих форм ГН с HCV-инфекцией окончательно не определена. По данным Итальянского регистра почечных биопсий, HCV-инфекция выявлена у 88,4% больных с криоглобулинемическим МКГН, существенно реже (17,8%) - у больных с МКГН без КГ. По нашим собственным данным, поражение почек диагностируется у 17,5% (10 из 57) больных с КГ, выявленной среди 130 больных гепатологического отделения с установленным диагнозом HCV. При этом среди больных с HCV-инфекцией и поражением почек морфологическая картина криоглобулинемического МКГН отмечена у 75% [9]. По мнению большинства исследователей, развивающийся у больных с HCV-инфекцией ГН имеет преимущественно криоглобулинемическую природу, хотя некоторые авторы отмечают возможность некриоглобулинемического поражения почек в рамках HCV-инфекции [6, 13-15]. Предполагают, что в генезе криоглобулинемического ГН основная роль принадлежит моноклональному компоненту смешанной КГ II типа благодаря наличию в его антигенсвязывающей части WA-кросс-идиотипа, обладающего уникальной способностью перекрестно связываться с тканевыми структурами почки, в частности, с фибронектином мезангиального матрикса [6]. Этим объясняют высокую частоту развития ГН при ассоциированной с HCV-инфекцией (HCV) КГ II типа (в 3 раза чаще по сравнению с КГ III типa). К развитию МКГН приводит отложение иммунных комплексов, состоящих из IgMκ-РФ и анти-HCV класса IgG в субэндотелиальном пространстве и мезангии клубочков почек (рис. 1). Показано, что персистенция HCV до появления смешанной КГ III типа составляет 7,6±7,7 года, до развития смешанной КГ II типа (наиболее нефритогенного типа) - 14,2±13,7 года, а возникновение ГН от первых проявлений КГ - около 4 лет (от 0 до 492 мес) [6, 9]. Мы оценили длительность периода инфицирования HCV до появления у больных признаков поражения почек и установили, что она составила в среднем около 197 мес [9]. У отдельных больных (14%) клинические признаки поражения почек возникали одновременно с другими системными проявлениями КГ (кожная пурпура, триада Мельтцера, нейропатия, синдромы Рейно и Шегрена, поражение желудочно-кишечного тракта, легких) и иногда даже предшествовали им («нефритические маски» КГ). Морфологические изменения в почках при криоглобулинемическом МКГН имеют некоторые особенности, позволяющие отличать его от идиопатического МКГН I типа. Этими особенностями являются: 1) внутрикапиллярные («внутрипросветные») тромбы, состоящие из преципитатов криоглобулинов и при электронной микроскопии имеющие вид фибриллярных или кристаллоидных структур; 2) гиперклеточность клубочков из-за массивной инфильтрации лейкоцитами, главным образом моноцитами (число инфильтрирующих моноцитов в острую стадию заболевания может достигать 80 клеток в одном клубочке, что в среднем в 4 раза больше, чем у больных, например, активным пролиферативным волчаночным нефритом); 3) выраженное удвоение и утолщение базальной мембраны клубочков почек (в большей степени за счет расположения по периферии моноцитов, а не в связи с интерпозицией мезангиального матрикса и мезангиальных клеток), 4) васкулит артерий мелкого и среднего калибра с участками фибриноидного некроза и моноцитарной инфильтрацией стенки (рис. 2, см. на цветной вклейке). Склеротические изменения чаще выражены умеренно и выявляются непостоянно. Однако примерно в 10% случаев обнаруживают картину МКГН с зонами центролобулярного склероза. Морфологическая и иммунологическая картина напоминает идиопатический лобулярный МКГН I типа, за исключением выраженной моноцитарной инфильтрации. У части больных (25%), обычно с умеренно выраженным мочевым синдромом, в том числе после интенсивной терапии, при гистологическом исследовании биопсийного материала отмечается картина мезангиопролиферативного ГН [6, 9, 16]. К клиническим критериям неблагоприятного прогноза криоглобулинемического ГН в рамках HCV-инфекции относят: старший (более 50 лет) возраст, рецидивирующую кожную пурпуру, повышение в дебюте заболевания уровня креатинина сыворотки (>1,5 мг/дл), низкий уровень С3 (10%). Морфологическими критериями неблагоприятного прогноза служат наличие массивных внутрикапиллярных (внутрипросветных) тромбов, острый васкулит почечных артерий с полями фибриноидного некроза и моноцитарной инфильтрацией стенки [6, 9]. До признания вируса гепатита С как этиологического фактора смешанной КГ традиционно у больных с криоглобулинемическим васкулитом применялись глюкокортикостероиды с присоединением или без добавления циклофосфана, внутривенное введение иммуноглобулина, плазмаферез (ПАФ). Однако эффективность такого лечения не была удовлетворительной и редко приводила к длительной ремиссии. Современное представление о связи HCV-инфекции с КГ изменило подход к лечению криоглобулинемического васкулита и его осложнений - первостепенное значение стали отводить этиотропной противовирусной терапии (ПВТ). Выбор тактики лечения больных HCV-криоглобулинемическим васкулитом основывается на тщательной оценке клинических проявлений и активности васкулита. Изолированное применение ПВТ рекомендуется при низкой активности васкулита, при его начальных проявлениях. При тяжелых формах HCV-криоглобулинемического васкулита рекомендуют применение активной патогенетической терапии с последующим курсом ПВТ. Патогенетическая терапия включает средства, направленные на устранение олиго- и моноклональной пролиферации В-лимфоцитов (антитела к CD20 В-лимфоцитам - ритуксимаб), на подавление иммунного воспаления, продукцию аутоантител и образование иммунных комплексов (традиционные иммуносупрессивные препараты - преднизолон, циклофосфан), ПАФ для быстрого удаления иммунных реактантов и медиаторов воспаления, а также симптоматическую терапию 18. Основные принципы терапии больных смешанной КГ, ассоциированной с HCV-инфекцией, представлены в табл. 1. Противовирусная терапия пегилированным интерфероном-α (ПегИНФ-α) и рибавирином долгие годы являлась золотым стандартом лечения пациентов с HCV-инфекцией, поскольку устранение этиологического фактора способно привести к стойкой ремиссии васкулита. В исследовании, проведанном в Клинике им. Е.М. Тареева, эффективность ПВТ препаратами ПегИНФ-α и рибавирина оценена в 18 наблюдениях криоглобулинемического васкулита, ассоциированного с HCV-инфекцией. Устойчивый вирусологический ответ (УВО) достигнут у 48,0%, полная клиническая ремиссия васкулита - у 68%, элиминация КГ - у 32,0%. Установлена ассоциация как клинического (χ2=20,23; p=0,002), так и иммунологического (χ2=29,11; p=0,005) ответа с достижением УВО. Эффективность ПВТ была наиболее высокой в отношении кожного и суставного синдромов (частота ремиссии 87,5 и 80% соответственно) и существенно ниже в отношении поражения периферической нервной системы (42%) и почек (58%). Отсутствие клинического ответа (у 4 больных с поражением почек) или развитие обострения васкулита, потребовавшие отмены ПВТ (у 4 больных; из них двое - с поражением почек), ассоциировались с исходно более высокой активностью васкулита и поражением почек. Эти данные согласуются с накопленным мировым опытом комбинированной терапии ПегИФН-α и рибавирином у больных HCV-ассоциированным криоглобулинемическим васкулитом, показавшим достижение ремиссии у 44-73% больных в зависимости от степени активности васкулита [20]. Внедрение в клиническую практику новых пероральных препаратов прямого противовирусного действия для лечения HCV-инфекции и ассоциированного с ней криоглобулинемического васкулита впервые показало возможность достижения УВО более чем у 95% пациентов, что значительно улучшает прогноз у этих пациентов 23. Препараты прямого противовирусного действия (ПППД) представляют собой ингибиторы неструктурных белков вируса NS3/4А (телапревир, боцепревир, симепревир, паритапревир, воксилапревир, асунапревир, гразопревир, глекапревир), NS5А (ледипасвир, даклатасвир, омбитасвир, элбатасвир, пибрентасвир и велпатасвир), NS5B - нуклеозидные аналоги (софосбувир) и ненуклеотидные ингибиторы (дасабувир, беклабувир). Применение ингибиторов протеазы NS3/4A первого поколения - телапревира и боцепревира, которые были одобрены для лечения ХГС в сочетании с ИФН-α/РБВ в 2011 г., хотя и увеличивали эффективность лечения, плохо переносились (из-за присутствия ИФН-α и RBV в схеме лечения) - почти у половины больных наблюдались нежелательные явления, и 93% из них нуждались в эритропоэтин-стимулирующих средствах для лечения анемии, индуцированной рибавирином. Новые безинтерфероновые препараты в настоящее время доступны к использованию, вызывая УВО в 95% и более случаев их применения и имеют небольшое количество нежелательных явлений. В 2015 г. комитетом Международной группы исследования внепеченочных проявлений HCV-инфекции (ISG-EHCV) возглавляемым Patrice Cacoub, опубликованы рекомендации по лечению внепеченочных проявлений HCV-инфекции. Согласно этим рекомендациям противовирусная терапия показана всем больным с HCV-инфекцией с внепеченочными проявлениями, особенно у пациентов с криоглобулинемическим васкулитом и поражением почек. В качестве стандартной терапии при HCV-инфекции с внепеченочными проявлениями рекомендуют применение ПППД без интерферона (с RBV или без него) [24]. Выбор комбинаций лекарственных средств и продолжительность лечения обычно определяются эффективностью схемы, генотипом, наличием у пациента цирроза и с учетом предшествующего опыта лечения ХГС [24] Стандартный курс терапии - 12 нед, при циррозе он может быть увеличен до 24 нед. Согласно рекомендациям KIDIGO, которые были опубликованы в 2018 г., для лечения пациентов с HCV-инфекцией и поражением почек при выборе схемы лечения необходимо учитывать скорость клубочковой фильтрации (СКФ; табл. 2) [25]. Многочисленные исследования показали, что терапия софосбувиром эффективна у пациентов с СКФ

Функциональные маркеры

CD4+CD45RA+/CD4+CD45RO+ Определение относительного количества “наивных” CD4+-лимфоцитов, «клеток памяти», а так же их соотношения рекомендуется выполнять при острых и хронических инфекционных заболеваниях.

CD45 – общий лейкоцитарный антиген представлен на поверхности всех лейкоцитов человека. Уровень экспрессии CD45 нарастает по мере дифференцировки гемопоэтических клеток от незрелых предшественников до зрелых форм. Максимальный уровень CD45 представлен на зрелых лимфоцитах. Существует несколько изоформ CD45. Антиген CD45RA экспрессируется на наивных Т-клетках, В-клетках и моноцитах.

CD45RO – экспрессируется на эффекторных Т-клетках, Т-клетках памяти, В-клетках, моноцитах и макрофагах.

Увеличение Т-лимфоцитов хелперов с фенотипом CD4+CD45RO+ (“клетки памяти”) характеризует активный гуморальный ответ на чужеродный антиген в прошлом и потенциальную возможность развития острых воспалительных при повторном контакте с чужеродным антигеном за счет сформированной иммунологической памяти.

Индекс снижается после перенесенного инфекционного заболевания и увеличение его в периоде реконвалесценции говорит о благоприятном течении заболевания. С возрастом индекс снижается за счет увеличения клеток памяти. Показано, что процент “наивных” CD4-лимфоцитов до начала терапии влияет на последующий прирост CD4-лимфоцитов у больных ВИЧ-инфекцией. При развитии инфекции, при хирургическом вмешательстве происходит накопление CD4 +CD45RO+ и снижение CD4+CD45RA+.

Функциональные маркеры CD4+/CD4OL+, CD4+/CD28+, CD8+/CD28+, CD8+/CD57+CD4+/CD4OL+ – тест рекомендуется назначать при нарушении гуморального ответа, для диагностики врожденных иммунодефицитов.

CD4OL – ко-стимулятор пролиферации Т-клеток, экспрессируется активированными Т-клетками. Играет центральную роль на различных фазах В-клеточного ответа на Т- зависимые антигены.

Следствием дефицита CD4OL является ослабление активности дендритных клеток, а именно выработки ими ИН12 и интерферона гамма, необходимых для дифференцировки Т-хелперов 1 и реализации воспалительного варианта клеточного иммунного ответа. Снижение относительного количества этих клеток наблюдается при врожденных иммунодефицитах (гипер–IgM-синдроме, который проявляется в ослаблении гуморального иммунитета – функциональная “слабость” IgM- антител), а также клеточного иммунитета. Численность Т- и В-лимфоцитов при этом не изменяется.

Повышение экспрессии CD4OL на Т-хелперах отмечено при хроническом лимфолейкозе и аутоиммунных заболеваниях.

CD4+/CD28+ – отражает относительное содержание Т-хелперов со сниженной функцией клеточной адгезии. Рекомендовано назначать при инфекционных заболеваниях различной этиологии. CD28 экспрессируется на большинстве Т-лимфоцитов (CD4+-клетки до 95%), активированных В-клетках, плазматических клетках. Принимает участи в активации Т-лимфоцитов, является индуктором пролиферации и продукции цитокинов. Котимулирующая молекула, играющая важную роль в иммунном ответе.

Снижение экспрессии CD28 на CD4-лимфоцитах отмечено при вирусных и бактериальных инфекциях различной этиологии, у пожилых.

CD8+/CD28+ – отражает относительное содержание ЦТЛ со сниженной функцией клеточной адгезии. Рекомендовано назначать при инфекционных заболеваниях различной этиологии. CD28 экспрессируется на большинстве Т-лимфоцитов (CD8+-клетки до 50%), активированных В-клетках, плазматических клетках. Принимает участие в активации Т-лимфоцитов, является индуктором пролиферации и продукции цитокинов. Ко-стимулирующая молекула, играющая важную роль в иммунном ответе. Снижение экспрессии CD28 на ЦТ лимфоцитах отмечено при вирусных и бактериальных инфекциях различной этиологии, у пожилых.

CD8+/CD57+ – дополнительный маркер нарушений функционирования иммунной системы при хронических заболеваниях. CD57 экспрессируется на NK-клетках, некоторых Т-лимфоцитах, В-лимфоцитах, моноцитах. Показано, что увеличение экспрессии на ЦТ лимфоцитах замедляет пролиферацию Т-клеток. Увеличение Т-лимфоцитов с фенотипом CD8+CD57+ отмечено при некоторых хронических инфекциях, в частности, при туберкулезе и ВИЧ-инфекции, синдроме Фелти, ТNK- клеточном лейкозе. При благоприятном течении заболевания, в процессе терапии, количество этих клеток нормализуется.

Тест используют при дифференциации нейроэндокринных опухолей. Снижение – при NK-клеточных лимфомах, болезни Лайма.

CD19+/CD5+популяция В-лимфоцитов (В1клетки). Тест рекомендован как дополнительный диагностический маркер при аутоиммунных заболеваниях и мониторинге лечения аутоиммунных заболеваний.

В настоящее время среди В-лимфоцитов выделяют три субпопуляции: В1, В2 и В-клетки памяти. При аутоиммунных заболеваниях В-лимфоциты начинают экспрессировать рецептор СD5. Их называют В1-клетки. В норме этот рецептор экспрессируется на Т-лимфоцитах, В-лимфоцитах до 1,3%, клетками лимфоидной ткани селезенки, вилочковой железы, принимает участие в регуляции пролиферации Т-лимфоцитов. Было выявлено, что В1-популяция увеличивается у пациентов, страдающих аутоиммунным тиреоидитом, СД 1 типа, СКВ, ревматоидным артритом, миастенией, в процессе лечения число этой популяции снижалось до нормальных величин. При пролиферации клонов этих клеток и преобразовании их в плазматические клетки происходит избыточная наработка аутоантител.

Маркеры пролиферации клеток. Смешенные маркеры клеток.

Исследование цитологических препаратов эпителия шейки матки, проводимое с использованием меченных флюоресцирующими веществами антител, которое позволяет выявить наличие и оценить степень присутствия на атипичных клетках специфичного маркера активности процессов клеточного деления.

Синонимы русские

Маркер пролиферации ki-67, оценка экспрессии онкопротеина ki-67 иммуноцитохимическим методом.

Синонимы английские

Marker Of Proliferation Ki-67, proliferation-related Ki-67 antigen, Ki-67 immunocytochemistry in liquid based cervical cytology.

Метод исследования

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Аспират из полости матки.

Как правильно подготовиться к исследованию?

Общая информация об исследовании

Одна из отличительных особенностей клеток злокачественных опухолей - способность к неограниченному делению, которое является основным фактором их биологической агрессивности. Процесс деления сопровождается появлением в клетке определенных белков, один из которых – ki-67. Он не продуцируется в клетках в состоянии покоя, что позволяет использовать его в том числе как маркер злокачественной трансформации. Исследование количества белка ki-67 в опухолевых клетках используется в диагностике и определении прогноза большинства злокачественных новообразований, в том числе его можно проводить в процессе скрининга на рак шейки матки.

Введение научно обоснованных программ скрининга позволило значительно снизить смертность от рака шейки матки, поэтому в настоящее время данный подход является одним из самых эффективных способов профилактики этого онкологического заболевания. Чаще всего скрининг включает в себя определение маркеров вируса папилломы человека (доказана связь рака шейки матки с ВПЧ-инфекцией) и цитологическое исследование. При этом диагностические возможности традиционного цитологического исследования весьма ограничены – по некоторым данным, его чувствительность составляет до 85%, он во многом лишен стандартизации, а достоверность результатов часто страдает по причине некачественного приготовления материала. В настоящее время золотым стандартом для диагностики патологии шейки матки считается метод жидкостной цитологии. Материал для исследования забирается цитощеткой, которая затем помещается в емкость со специальным консервирующим раствором. Он предотвращает преждевременное высыхание клеток, способствует сохранению их морфологических и молекулярно-биологических свойств, а также минимизирует содержание в образце постороннего материала (слизи, клеток периферической крови, элементов воспаления и разрушенных клеток). В дальнейшем с помощью специального оборудования изготавливается однослойный цитологический препарат, который врач-цитолог изучает под микроскопом. Характер патологических изменений, выявленных при цитологическом исследовании, оценивается в соответствии с общепринятой международной системой Bethesda – она представляет собой набор аббревиатур, используемых для обозначения цитологических заключений:

NILM - Negative for Intraepithelial Lesion or Malignancy (отрицательные в отношении интраэпителиальных поражений или злокачественности - норма);

AGC - Atypical Glandular Cells (атипичные клетки железистого эпителия);

ASC-US - Atypical squamous cells of undetermined significance (атипичные клетки плоского эпителия неясного значения);

ASC-H - Atypical squamous cells cannot exclude HSIL (атипичные клетки плоского эпителия, не позволяющие исключить внутриэпителиальные поражения высокой степени злокачественности);

LSIL - Low-grade squamous intraepithelial lesion (внутриэпителиальные поражения низкой степени злокачественности);

HSIL - High-grade squamous intraepithelial lesion (внутриэпителиальные поражения высокой степени злокачественности);

AIS - Adenocarcinoma in situ (аденокарцинома in situ).

При выявлении по данным цитологического исследования интраэпителиальных изменений плоского эпителия низкой степени (LSIL), атипичных клеток плоского эпителия неясного значения (ASC-US) и атипичных клеток железистого эпителия (AGC) рекомендуется дополнительное обследование на содержание в атипичных клетках белка ki-67. Для анализа используется тот же материал, что и для жидкостной цитологии (однократное взятие биологического материала для исследования методом жидкостной цитологии позволяет проводить также и дополнительные диагностические исследования без повторных гинекологических манипуляций). Содержание белка ki-67 в атипичных клетках определяется с помощью иммуноцитохимического исследования. Для этого из взвеси клеток готовят мазки, которые затем окрашивают раствором антител, меченных флюоресцирующими метками, специфичными к ki-67. Если в опухолевой клетке присутствует искомый белок, антитела связываются с ним и при просмотре стекла под специальным микроскопом можно увидеть флюоресценцию, что будет свидетельствовать о положительном результате теста. Степень флюоресценции и процент клеток, в которых она есть, лежит в основе интерпретации результатов иммуноцитохимического анализа.

Для чего используется исследование?

Для выявления в атипичных клетках цервикального эпителия маркера пролиферативной активности, который позволяет с высокой вероятностью подтвердить или исключить злокачественную трансформацию.

Когда назначается исследование?

При выявлении по результатам цитологического исследования цервикального мазка определенных изменений (по классификации Bethesda): LSIL, ASC-US и AGC.

Что означают результаты?

В норме Ki‑67 определяется только в клетках нижних слоев плоского эпителия слизистой оболочки наружной части шейки матки. При дисплазии клетки, экспрессирующие Ki‑67, появляются в верхних слоях эпителия; данный маркер может экспрессироваться в значительной части клеток в очагах незрелой плоскоклеточной метаплазии.

Что может влиять на результат?

Соблюдение правильности техники взятия биологического материала для исследования.

Важные замечания

При необходимости взятия биоматериала для нескольких исследований материал для данного анализа берется в первую очередь.
Исследование на ki-67 необходимо комбинировать с определением в атипичных клетках еще одного молекулярного маркера – белка р16 INK4 a . Именно их комбинация является высокочувствительным диагностическим методом. Белок р16 обладает антипролиферативной активностью, в нормальной клетке экспрессия ki-67 и р16 взаимно исключают друг друга. Выявление одновременной экспрессии в клетке и ki-67, и р16 свидетельствует о нарушении клеточного цикла и коррелирует с индуцированной вирусом папилломы человека злокачественной трансформацией.
Интерпретация результатов исследования должна проводиться исключительно врачом соответствующей специальности.

Также рекомендуется

Скрининг рака шейки матки: жидкостная цитология c ВПЧ-тестом (Roche Cobas 4800)

Цитологическое исследование мазков (соскобов) с поверхности шейки матки (наружного маточного зева) и цервикального канала на атипию

Жидкостная цитология. Исследование соскоба шейки матки и цервикального канала (окрашивание по Папаниколау)

Иммуноцитохимическое исследование соскобов шейки матки с определением белка р16

Иммуноцитохимическое исследование соскобов шейки матки с определением белка р16 и Ki 67 (включая жидкостную цитологию - окрашивание по Папаниколау)

Human Papillomavirus низкого (HPV 6, 11, 44) и высокого (HPV 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73, 82) канцерогенного риска, ДНК (выявление, генотипирование и количественное определение) [реал-тайм ПЦР]

Антиген плоскоклеточной карциномы (SCCA)

Кто назначает исследование?

Литература

Диагностическая ценность иммуноцитохимического метода при ВПЧ-ассоциированных заболеваниях шейки матки. А. Р. Хачатурян, Е. К.Орехова, Г. Х. Толибова, Т. Г. Траль. Журнал акушерства и женских болезней. Выпуск 3, том LXIV, 2015. С. 47-51.

Скрининг рака шейки матки. Взгляд клинициста. Ю. Г. Паяниди, Л. Г. Комарова, В. П. Козаченко, В. В. Кузнецов, А. Ю. Кашурников, К. И. Жорданиа. Онкогинекология, №1, 2013. С. 35-41.

Sahebali S, Depuydt CE, Segers K, Vereecken AJ, Van Marck E, Bogers JJ. Ki-67 immunocytochemistry in liquid based cervical cytology: useful as an adjunctive tool? Journal of Clinical Pathology. 2003;56(9):681-686.

Вопросы диагностики онкоцитарных новообразований щитовидной железы в рамках оптимизированного протокола обследования

Паренхима щитовидной железы (ЩЖ) представлена тремя видами клеток, отличающимися друг от друга ультраструктурно, гистохи-мически и функционально (Краевский Н.А. и соавт., 1971; Краевский Н.А., Райхлин Н.Т., 1975): фолликулярными (собственно тиреоци-ты), оксифильными (онкоциты, называемые также клетками Ашкенази-Гюртле) и пара-фолликулярными нейроэндокринными (С-клетки) (Бомаш Н.Ю., 1981; Пачес А.И., Пропп Р.М., 1984; LiVolsi V., 1990; Rosai J., 1996).

Клетки, выстилающие полость фолликулов, называются фолликулярными, или А-клетка-ми, составляют основную массу целлюлярного состава ЩЖ, бывают трех видов в зависимости от формы и осуществляют синтез йодсодер-жащих гормонов ЩЖ - тироксина и трийод-тиронина. Кубические А-клетки достигают в диаметре 12-13 мкм, цилиндрические А-клетки размером до 16-18 мкм несколько сужены в базальной части (основании), уплощенные А-клетки типично неправильно округлые при вариабельности размеров, но для ЩЖ чаще специфичны крупные формы. Изменения формы и размеров тирео-цитов многие авторы связывают с изменениями функционального состояния органа.

В-клетки (онкоциты, клетки Ашкенази-Гюртле, оксифильные клетки) располагаются в центре фолликулов, среди А-клеток, или между фолликулами, имеют относительно крупные размеры (от 15 до 25 мкм), округлую или шаровидную форму с эксцентрически расположенным ядром среднего или несколько большего размера. В цитоплазме имеется обильная крупная зернистость, окрашивающаяся в интенсивно красный или розовый цвет. Число клеток Ашкенази-Гюртле может быть различным - они могут быть единичными или, независимо от величины фолликула, выстилать его полностью или частично. В материале ТиАПБ эти клетки обнаруживаются в небольшом количестве, располагаются раздельно, а при пролиферации -образуют группы и пласты (рисунок 2). Ок-сифильные клетки отличаются от фолликулярного эпителия (тиреоцитов) значительно большей величиной, эозинофильной гранулированной цитоплазмой и округлым крупным ядром с выраженным ядрышком. Характерной особенностью ультраструктуры В-клеток является высокое содержание митохондрий (рисунок 3) округлой или овальной формы, среди которых расположены секреторные гранулы (За-ридзе Д.Г., 1976; Богданова Т.И. и соавт., 2000), нередко практически полностью заполняющие цитоплазму. Онкоциты обладают высокой метаболической активностью: в них обнаруживается высокая экспрессия окислительно-восстановительных ферментов, в частности, сукцинатдегидро-геназы, что отличает их от фолликулярного эпителия (Бомаш Н.Ю., 1981; Богданова Т.И. и соавт., 2000). В цитоплазме окси-фильных клеток Н.А. Краевским и соавторами. (1971), а также О.К. Хмельницким и сотрудниками (1974) были выявлены биогенные амины, в том числе - серотонин, а J.V Nesland и M.A. Sorbinho-Simoes (1985) -тиреоглобулин. Накопление биогенных аминов, по мнению этих авторов, является функцией В-клеток ЩЖ. Активность сукци-натдегидрогеназы в фолликулярных (А-) клетках низкая, иногда увеличивается при зобе, впрочем незначительно.

В литературе встречается мнение, что фолликулярные клетки и клетки Ашкенази-Гюртле близки между собой. Так, методами световой микроскопии обнаруживают переходные формы между ними, особенно заметные при аутоиммунном тиреоидите (АИТ) и диффузном токсическом зобе. Переходные формы описали В.Ф. Кондаленко и В.А. Одинокова (1973), изучая ультраструктуру онкоцитов при узловом нетоксическом зобе. Е.А. Смирнова (1974), исследуя опухоли ЩЖ гистологическими и гистохимическими методами, пришла к выводу о наличии общих стволовых элементов фолликулярных и оксифильных клеток ввиду образования ими одинаковых структур. Также интересен и требует интерпретации факт выявления среди гиперфункцио-нирующих (токсических) аденом ЩЖ новообразований из клеток Ашкенази-Гюртле, а также интенсивного накопления радиоактивного йода в выстланных онкоци-тами микрофолликулах в ходе гистоавто-радиографического исследования при АИТ (Бомаш Н.Ю., 1981). Упомянутые данные представляются нам требующими ряда дополнительных исследований.

Онкоциты в норме и при патологии

Онкоциты, или клетки Ашкенази-Гюртле, в умеренном количестве присутствуют в ткани здоровой ЩЖ. Процессы пролиферации и гиперплазии онкоцитов описаны и наблюдались нами при диагностике и исследовании некоторых патологических состояний органа. Сохраняя яркие морфологические отличия от фолликулярных, оксифильные клетки не всегда одинаковы. В аденомах они более однообразны, однако могут отличаться по величине в отдельных узлах. При токсическом зобе и АИТ онкоциты могут быть настолько полиморфны и атипичны (разные размеры клеток, гиперхром-ные ядра неправильной формы), что нередко возникает ошибочное подозрение в отношении злокачественного роста. При диффузном токсическом зобе, в особенности при выраженной гиперплазии эпителия, нередко обнаруживаются эпителиоциты, резко отличающиеся от остальных клеток ЩЖ -очень крупные с широкой эозинофильной зернистой цитоплазмой и резко гиперхром-ным крупным ядром, иногда неправильной формы (В-клетки). Они могут выстилать отдельные фолликулы, образовывать целые дольки, лежать обособленными мелкими группами или изолированно среди фиброзной ткани, а также образовывать узлы (аденомы). В большинстве случаев наблюдаются признаки очаговой лимфоидной инфильтрации вблизи крупных сосудов и участков пролиферации тиреоидного эпителия. В них возможна оксифильноклеточ-ная трансформация тиреоидных клеток, что свидетельствует о наличии у этих больных хронического тиреоидита (Богданова Т.И. и соавт., 2000) (рисунок 4). Онкоциты при диффузном токсическом зобе отличаются выраженным полиморфизмом, что нередко требует пристального внимания цитолога в ходе исследования, однако наличие лимфоидной инфильтрации может служить в данном случае четким дифференциально-диагностическим признаком.

При обследовании больных с АИТ наличие пролиферации В-клеток служит важным диагностическим признаком. Характерной особенностью при этом является обширная инфильтрация ЩЖ лимфоидны-ми клетками, формирование лимфоидных фолликулов с выраженными центрами деления, а также наличие очаговой окси-фильноклеточной трансформации тирео-идного эпителия (Бомаш Н.Ю., 1981; LiVolsi V., 1994). Последняя обычно отмечается в небольших фолликулах, расположенных вблизи крупных очагов лимфоидной инфильтрации. Степень оксифильноклеточ-ной трансформации у различных пациентов может значительно варьировать. Окси-фильноклеточная трансформация при пе-ритуморальном тиреоидите выражена слабо (Богданова Т.И. и соавт., 2002). Признаки АИТ обусловлены, главным образом, двумя процессами, развивающимися в ЩЖ при этом заболевании: лимфоплазмоци-тарной инфильтрацией и склерозированием стромы органа. При общем осмотре ткань ЩЖ больных АИТ имеет характерный вид: на темном фоне густой лимфоплазмо-цитарной инфильтрации ярко выделяются мелкие фолликулы, тяжи и отдельные клетки крупного светлого оксифильного эпителия (рисунок 6). Вид этих клеток очень характерен - клетки в 3-4 раза крупнее обычных, с широкой оксифильной зернистой цитоплазмой, ядра расположены центрально, часто гиперхромные (рисунок 7). Разная величина клеток, гиперхроматоз и полиморфизм ядер - все это может создавать ошибочные представления об опухолевом росте, однако наличие выраженной лимфоидной инфильтрации убеждает в воспалительной природе данной патологии. Гистохимическое исследование выявляет в этих клетках высокую активность сук-цинатдегидрогеназы.

Микроскопически АИТ сопровождается триадой гистологических изменений, описанных Хакару Хашимото: 1) диффузная лимфоплазмоцитарная инфильтрация с формированием многочисленных центров клеточного деления; 2) атрофия тиреоид-ных фолликулов, связанная с пролиферацией соединительной ткани; 3) выраженная оксифильноклеточная метаплазия, не очаговая, как при одноименном варианте хронического тиреоидита, а захватывающая обычно большую часть эпителия (Hashimoto H., 1912). В области лимфоплаз-моцитарной инфильтрации тиреоидный эпителий состоит из клеток Ашкенази-Гюр-тле, однако они могут быть меньших размеров и менее эозинофильны, что создает впечатление переходных форм между типичными онкоцитами и фолликулярным эпителием. В материале ТиАПБ у больных АИТ среди скоплений лимфоидных клеток наблюдаются отдельные кубические А-клетки, иногда их пласты или железистопо-добные структуры, пролиферирующий эпителий и большое количество В-клеток

При электронной микроскопии в цитоплазме этих клеток обычно определяются многочисленные митохондрии (рисунок 9) (Заридзе Д.Г., 1978; Богданова Т.И и соавт., 2002). Обнаружение в препарате ТиАПБ хотя бы единичных уплощенных А-клеток, наличие В-клеток и выраженной лимфоидной инфильтрации позволяет поставить диагноз. В пункционном материале при тиреоидите Риделя В-клетки отсутствуют.

Камни преткновения классификации

Вопрос о месте онкоцитарных неоплазий в классификации опухолей ЩЖ является дискуссионным. Некоторые авторы определяют аденому и карциному из клеток Ашкена-зи-Гюртле как отдельные виды новообразований органа, другие же не выделяют эти опухоли из множества фолликулярных аденом и карцином соответственно. Бесспорно, впрочем, что рак из В-клеток относится к дифференцированным злокачественным новообразованиям ЩЖ. В соответствии с классификацией ВОЗ

для тиреоидных опухолей, которую используем и мы в своей работе, онко-цитарные аденомы не выделяются в отдельную группу, а относятся к разновидности фолликулярных аденом (микрофолликулярных, трабекулярных или солидных), а оксифильноклеточные раки выделяются как варианты фолликулярной и папиллярной карцином с соответствующим гистологическим/цитологическим строением и поведением опухолей.

Гистологическая классификация опухолей щитовидной железы (Богданова Т.И. и соавт., 2000)

Маркеры пролиферации опухолевых клеток в раковых опухолях гортани

Одним из ключевых клинико-морфологических параметров раковой опухоли, наряду с инвазивностью, степенью анаплазии, васкуляризацией, апоптозом, считается интенсивность пролиферации в клетках новообразования [12, 21]. Рост пролиферативной активности раковых клеток в конечном счете ведет к появлению мультиклональных субпопуляций и к увеличению шансов того, что некоторые из них приобретут способность к метастазированию [27]. Имеются различные подходы в оценке интенсивности клеточного цикла в опухолях. Традиционными методами являются подсчет митотического индекса, индекса включения тимидина [22] и проточная цитометрия, выявляющие клетки, находящиеся в фазе синтеза клеточного цикла. Достаточно новый подход к исследованию кинетики клетки — это простое серебрение белка, ассоциированного с ядрышковым организатором (AgNOR) [20].

В последние годы для изучения пролиферативных процессов в опухоли используется иммуногистохимический анализ молекул, играющих важную роль в клеточном цикле [5]. К ним относятся белки Кі-67, МРМ-2, PCNA, ряд циклинов и др. Гибридомные технологии позволили получить моноклональные антитела, выяляющие эти молекулы в парафиновых и криостатных срезах различных опухолей человека. PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen — антиген ядер пролиферирующих клеток), ядерный белок с молекулярной массой 36 кДа, является вспомогательным полипептидом дельта ДНК-полимеразы [9]. PCNA был впервые выделен Miyachi [17] из сыворотки пациентов с I системной красной волчанкой. Содержание PCNA в ядрах повышается в S-G2 -фазах клеточного цикла и отсутствует в фазе Go.

Другой ядерный антиген Кі-67 экспрессируется во всех активных фазах цикла [7] и быстро разрушается по его окончании [8]. Как и PCNA, этот антиген выявляется при иммуногистохимическом исследовании в ядрах пролиферирующих клеток и отсутствует в покоящихся клеточных элементах нормальных тканей. Антитела к другому маркеру — белку МРМ-2 — окрашивают цитоплазму клеток, находящихся в фазе митоза. МРМ-2 антиген синтезируется в течение интерфазы и фосфорилируется в М-фазе.

В ряде опухолей человека найдена корреляция между количеством клеток, окрашенных PCNA, Кі-67 (индекс Кі-67 или PCNA ) и степенью гистопатологической дифференцировки. Увеличение индекса PCNA прямо коррелирует с частотой метастазирования опухоли в регионарные лимфатические узлы [26].

Индекс мечения PCNA используется для прогноза ответа на лучевую и химиотерапию. Лучший ответ на облучение отмечен у больных с высоким индексом PCNA в раковых опухолях шейки матки [19] и гортани [18]. Tsuji Т. и соавт. [24] обнаружили снижение экспрессии PCNA после химиотерапии ротоглоточного рака, что позволило им оценивать ответ раковых клеток на антибластомные препараты последовательным измерением индекса PCNA. В то же время работ, касающихся пролиферативной активности клеток рака гортани, в литературе недостаточно, и их результаты противоречивы [4]. Корреляция между индексом PCNA и гистопатологической дифференцировкой опухоли показана рядом авторов [12, 14], хотя в исследованиях других подобная закономерность не обнаружена [18, 21].

Целью нашего исследования являлось изучение закономерностей пролиферативных процессов, происходящих в клетках рака гортани.

Материалом для иммуногистохимического исследования служили криостатные и парафиновые срезы 66 плоскоклеточных раков и нормальный эпителий гортани, не пораженный опухолью (см. табл.). Использовались следующие моноклональные антитела: 1) клона PC 10 (DAKO) к антигену ядер пролиферирующих клеток (PCNA); 2) МКАТ клона Кі-67 (DAKO); 3) клона МРМ-2 (DAKO). Индекс пролиферации подсчитывали с использованием морфометрической окулярной сетки в 20 полях зрения, при этом учитывали 500 клеток [1|. Мы считали ядра позитивно окрашенными при реакции любой интенсивности. Статистическую обработку производили с помощью критерия Вилкоксона— Манна—Уитни. В качестве системы визуализации применяли стрептавидин-биотиновый метод в наборе LSAB+ (DAKO); пероксидазу проявляли раствором диаминобензидина или аминоэтилкарбазола.

Распределение больных по полу, возрасту и локализации новообразований

Читайте также: