Гистохимия опухоли. Гистохимические особенности опухолей.

Обновлено: 16.05.2024

Черданцева Т.М. 1 Бобров И.П. 1 Климачев В.В. 1 Брюханов В.М. 1 Лазарев А.Ф. 1 Авдалян А.М. 1 Гервальд В.Я. 1 Долгатов А.Ю. 1

Изучены особенности гистологического строения перитуморозной зоны (ПЗ), а также биосинтетических и пролиферативных процессов, происходящих в сосудах и системе эпителий-соединительная ткань в тканях, прилежащих к раку почки. Показаны отличия в строении ПЗ в зависимости от плоидности опухоли. В ПЗ полиплоидных опухолей усиливались фибропластические, склеротические и пролиферативные процессы. В зонах выраженного склероза в ПЗ отмечены очаги выраженной дисплазии тубулярного эпителия, которые при микроспектрофотометрии ДНК были неотличимы от рака. Также в ПЗ полиплоидных опухолей обнаружена редукция предсуществующих сосудов и возникновение патологического неоангиогенеза. Высокая плотность сосудов микроциркуляции соотносилась с высоким темпом пролиферации эндотелия (по данным серебрения ядрышковых организаторов) и коррелировала с наличием регионарных и отдаленных метастазов (r = 0,72).

1. Прогностическое значение исследования плотности сосудов микроциркуляторного русла в опухоли и перитуморозной зоне по данным выявления белка CD31 и количества аргирофильных белков области ядрышкового организатора (AgNOR) в эндотелии при лейомиосаркоме тела матки / А.М. Авдалян, И.П. Бобров, В.В. Климачев, Н.М. Круглова, A.Ф.Лазарев // Фундаментальные исследования. - 2010. - №5. - С. 12-20.

2. Модификация гистохимического метода выявления ядрышковых организаторов на гистологических срезах / И.П. Бобров, А.М. Авдалян, В.В. Климачев, А.Ф. Лазарев, В.Я. Гервадьд, А.Ю. Долгатов, О.В. Самуйленкова, М.В. Ковригин, Д.С. Кобяков // Архив патологии. - 2010. - T. 72, №3. - С. 35-37.

3. Федосенко К.Ф. Некоторые особенности биосинтетических и пролиферативных процессов в эпителии и строме предстательной железы при нодозной гиперплазии, раке и в перитуморозной зоне // Вопросы онкологии. - 2002. - Т. 48, №1. - C. 47-50.

5. Fuhrman S.A., Lasky L.C., Limas C. Prognostic significance of morfologic parameters in renal cell carcinoma // Am. J. Surg. Pathol. - 1982. - Vol.6. - P. 655-663.

6. Mairinger T., Mikuz G., Gschwendter A. Nuclear chromatin texture analysis of nonmalignant tissues can detect adjacent prostatic adenocarcinoma // Prostate. - 1999 - Vol. 41. - P. 12-19.

8. Nativ O., Sabo E., Reiss A. Wald M, Madjar S. Moskovitz B. Clinical significance of tumor angiogenesis in patients with localized renal cell carcinoma // Urology. - 1998. - Vol. 51. - P. 693-696.

9. Kirkali Z., Yorukoglu K., Ozkara E., Kazimoglu H., Mungan U. Proliferative activity, angiogenesis and nuclear morphometry in renal cell carcinoma // Int J Urol. - 2001 - Vol 8. - P. 697-703.

10. Howell W.M., Black D.A. Controlled silver staining of molecular organizer regions with protective colloidal development - a 1 step method // Experimentia. - 1980. - Vol. 36. - P. 1014-1015.

В последние годы выявлен целый ряд изменений, происходящих вблизи опухоли при раке различных локализаций [1, 3, 4, 6, 7]. Показано, что перитуморозная зона (ПЗ) при многих злокачественных новообразованиях имеет важное биологическое значение. Изучение изменений тканей, граничащих с опухолью, важно для выявления фоновых процессов, способствующих развитию опухоли. Именно к этой зоне относится понятие «опухолевое поле» и в ней начинается рост опухоли, но также ПЗ во многом способствует прогрессии уже возникшей опухоли. Для оценки морфофункциональных изменений, происходящих в ПЗ, наиболее информативным является изучение системы эпителий-соединительная ткань.

Ангиогенез имеет важное значение для роста и распространения рака почки [8, 9]. Однако при сложившемся мнении о неблагоприятном значении активного опухолевого ангиогенеза влияние развития микроциркуляторного русла в ПЗ на прогрессию рака почки изучено недостаточно.

Есть основания полагать, что биологическое и клиническое поведение опухоли в значительной степени зависит от интенсивности пролиферации и генетических нарушений, отражением которых может служить несбалансированность содержания ядерной ДНК (полиплоидия и анеуплоидия) опухолевых клеток. Наиболее прогностически неблагоприятными формами анеуплоидии являются многоклоновые опухоли.

Исследований, посвященных изучению биосинтетических и пролиферативных процессов в системе эпителий-соединительная ткань в тканях, прилежащих к раку почки, и влиянию на эти процессы плоидности опухоли, в доступной литературе, нами не обнаружено.

Цель исследования: изучить особенности гистологического строения перитуморозной зоны, а также биосинтетических и пролиферативных процессов, происходящих в сосудах и системе эпителий-соединительная ткань в тканях, прилежащих к раку почки, в зависимости от плоидности опухоли.

Материал и методы исследования

Изучен операционный материал 32 больных раком почки. Средний возраст больных составил 53,4 ± 1,2 года. Мужчин было 18 (56,2 %), женщин 14 (43,8 %). По гистологическому строению опухоли были представлены светлоклеточным раком. При группировке опухолей по клиническим стадиям (I-IV) было выделено: I стадии (T1N0M0) соответствовали 14 (43,8 %) наблюдений; II стадии (T2N0M0) 1 (3,1 %) наблюдение; III стадии (T1N1M0, T2N1M0, T3N0M0, T3N1M0) - 7 (21,9 %) и IV стадии (T4N0M0, T4N1M0, T^k^N2M1, - 10 (31,2 %).

Материал для исследования забирали из центра опухоли, перитуморозной зоны и неизмененной ткани почки, из максимально отдаленных от опухоли участков. За ПЗ принимали непосредственно прилежащую к псевдокапсуле ткань опухоли, псевдокапсулу и ткань, расположенную за псевдокапсулой до неизмененной ткани почки.

Степень злокачественности клеток опухоли оценивали по Fuhrman S.A. et al., (1982) [5]. В изученном материале было 12 (37,5 %) опухолей степени анаплазии G1, 11 (34,4 %) опухолей степени анаплазии G2 и 9 (28,1 %) степени G3.

При анализе биосинтетических и пролифератив- ных процессов элементов перитуморозной зоны использовался комплексный подход с применением различных методов окраски: гистологических - окраска гематоксилином и эозином; гистохимических - окраска на коллаген по ван Гизон; на эластические волокна - резорцин - фуксином по Вейгерту; серебрение аргирофильных волокон по Гомори; на нейтральные гликозаминогликаны (ГАГ) ШИК - реакция по Мак-Манусу; на кислые ГАГ - окраска альциановым синим по Стидмену и коллоидным железом по Хейлу; на ДНК по Фельгену; на общие нуклеиновые кислоты по Эйнарсону и на активность аргирофильных белков, ассоциированных с областью ядрышковых организаторов (AgNOR) по Howel W.M., Black D.A. [10], в нашей модификации [2]. В каждом случае на масляной иммерсии при увеличении *1000 рассчитывали плотность микроциркуляторного русла (ПМЦР) в 20 произвольно выбранных полях зрения.

Морфометрические и микроспектрофотометрические исследования проводили с использованием системы компьютерного анализа изображений, состоящей из микроскопа Leica DМЕ, цифровой камеры Leica БС3 («Leica Microsystems AG», Германия), персонального компьютера Pentium 4 и программного обеспечения ВидеоТест - Морфология 5,2. Плоидометрию ДНК проводили на гистологических срезах, окрашенных по Фельгену. Среднее содержание ДНК в ядрах малых лимфоцитов принимали за диплоидное (2 с) и использовали в качестве стандарта. Для получения стандарта в каждом срезе оценивали 25-30 лимфоцитов. Затем в исследуемых эпителиальных клетках высчитывали индекс накопления ДНК (ИНДНК) в единицах плоидности (с) и строили гистограммы клонального распределения клеток, по количеству генетического материала выраженного в процентах. Выделяли две группы опухолей:

Статистический анализ проводили с помощью пакета программ Statistica 6,0. Рассчитывали среднее арифметическое значение (М), ошибку среднего значения (m), достоверность различия средних, которую рассчитывали с помощью t-критерия Стьюдента, данные считали достоверными при p < 0,05. Корреляционные взаимосвязи определяли путем расчета коэффициента корреляции Пирсона.

Результаты исследования и их обсуждение

В процессе исследования материал был нами распределен на 2 группы: диплоидные и полиплоидные опухоли. Диплоидных опухолей оказалось 12 (37,5 %), полиплоидных - 20 (62,5 %). ИНДНК клеток опухолей имел сильную положительную взаимосвязь со степенью анаплазии опухоли (G) (r = 0,82).

Для изучения процентного содержания клонов клеток для каждой группы были построены гистограммы клонального распределения по количеству генетического материала.

Гистограмма распределения ядер по количеству ДНК в группе диплоидных опухолей (группа I) имела унимодальный характер с пиком в области 2-3 с. (рис. 1).

Рис. 1. Гистограмма распределения ядер по содержанию ДНК в диплоидных опухолях.

По оси абсцисс - количество ДНК (в единицах плоидности); по оси ординат - количество клеток (в процентах)

Гистограмма распределения ядер по ко - личеству ДНК в группе полиплоидных опухолей (группа II) имела вид широкого плато, со сдвигом вправо и разбросом значений от 2 до 13 с, что отражало значительную многоклоновость, поли- и анеуплоидию (рис. 2).

Рис. 2. Гистограмма распределения ядер по содержанию ДНК в полиплоидных опухолях. По оси абсцисс - количество ДНК (в единицах плоидности); по оси ординат - количество клеток

ПЗ рака почки имела различное гистологическое строение. Ширина ее колебалась от 152,5 до 2399,1 мкм и в среднем составила - 879,2 ± 92,8. Размеры и гистологическое строение ПЗ опухолей зависели, прежде всего, от плоидности опухоли (табл. 1).

Так, у полиплоидных новообразований (группа II) ширина ПЗ в среднем составила 1053,6 ± 119,4 мкм. При окраске по ван Гизон в таких ПЗ отмечалась выраженная фуксинофилия коллагеновых волокон, волокна давали интенсивную ШИК-реакцию при окраске по Мак-Манусу на нейтральные ГАГ. При окраске на эластические волокна резорцином фуксином по Вейгерту отмечено большое число тонких извитых волокон интенсивной сиреневой окраски, также отмечались толстые эластические мембраны на границе между опухолевой тканью и ПЗ. Аргирофильные волокна были утолщены, на границе ПЗ с опухолью они образовывали сплетения и мембраны. Кислые ГАГ отмечали в значительном количестве в зонах обнаружения эластических волокон. Плотность лимфо-плазмоцитарной инфильтрации в ПЗ была умеренной или высокой, часто были видны фолликулоподобные структуры.

У диплоидных опухолей (группа I) ширина ПЗ в среднем составила 580,5 ± 71,4 мкм. Коллагеновые волокна при окраске по ван Гизону в таких ПЗ окрашивались в розоватый цвет с участками желтого, в то же время волокна коллагена были ШИК-позитивны при реакции по Мак-Манусу на нейтральные ГАГ. Кислые ГАГ в соединительной ткани не обнаруживались, но определялись в стенках сосудов. При окраске на эластические волокна резорцином - фуксином по Вейгерту отмечено высокое содержание тонких извитых волокон, тонкие эластические мембраны на границе с опухолью обнаруживались лишь на некоторых участках. В пучках коллагеновых волокон определялись истонченные «штопорообразные» аргирофильные волокна. Плотность лимфо-плазмоцитарной инфильтрации была слабой или умеренной.

Морфометрические параметры элементов ПЗ в зависимости от плоидности опухоли

Гистохимия опухоли. Гистохимические особенности опухолей.

После того, как выбран метод забора материала от пациента (биопсия, оперативное вмешательство в объеме удаления органа), все выделенные фрагменты должны быть как можно быстрее доставлены в лабораторию патоморфологии. Скорость необходима для того, чтобы приблизить пациента к получению диагноза и незамедлительно начать проведение того или иного терапевтического курса. Ведь существует ряд опухолей (например, некоторые лимфомы), при которых счет идет на дни, а иногда на часы.

Весь материал необходимо погрузить в забуференный 10% формалин в соотношении 1:10 (одна часть материала к 10 частям формалина). Это позволяет непосредственно после операции начать фиксацию тканей, предотвратить их распад и, соответственно, сохранить все структуры материала в неизменном виде до момента просмотра патоморфологом.

Следует знать, что каждый отдельно выделенный фрагмент должен быть помещен в отдельный контейнер с маркировкой. Например, нефрэктомия (удаление почки) с резекцией (иссечением) диафрагмы и выделением регионарных лимфатических узлов. Отдельно помещается почка, отдельно – резецированная часть диафрагмы, отдельно – лимфатические узлы. Или: лимфатические узлы брюшной полости, образование средостения, шейные лимфатические узлы. Недопустимо «смешивать» материал в одном контейнере.

После фиксации, которая занимает от нескольких часов до, что редко, суток, материал отправляется в проводку. На этом этапе он проходит через различные спирты или специализированные растворы, что позволяет подготовить его к работе (обезжирить и дополнительно фиксировать). Существует несколько способов проводки материала. Основные – вакуумная проводка и экспресс. Экспресс проводка длится от 1,5 до 3-х часов, пригодна для любого вида материала и позволяет в наиболее краткие сроки получить готовый к работе образец. Вакуумная проводка длится до 12 часов, позволяет подготовить различные типы тканей, в том числе и наименее фиксированные, а также позволяет «загружать» материал на выходные и получать его в готовом виде в понедельник, что экономит время.

После проводки все образцы заливают в парафин в специальные формы (гистологические кассеты, парафиновые блоки), в которых они застывают. Здесь (в парафине) весь материал хранится вечно.

После заливки в парафин материал поступает в кабинет к лаборантам, где и происходит один из самых важных этапов работы – приготовление гистологических препаратов. На специальных аппаратах – микротомах – лаборант делает срезы с парафиновых блоков толщиной до 1,0мкм и укладывает их на специальные гистологические стекла.

Недаром здесь употреблены слова «важный этап». На сегодняшний момент невозможно представить ни одну лабораторию без хороших лаборантов, на 100% профессионально владеющих своими навыками. Без их полной самоотдачи весь последующий этап (а именно работа врача) сводится на нет. От хорошо приготовленного препарата зачастую зависит половина успеха в постановке диагноза. И это не просто слова. Очень важно получить срез нужной толщины, где клетки лежат в один слой, а не накладываются друг на друга в несколько слоев, создавая ошибочную гиперклеточную картину. Важно видеть весь срез полностью, а не «расплывшийся» или срезанный наполовину или «в складку». Все эти моменты значительно затрудняют процесс диагностики и требуют повторного приготовления препаратов необходимого качества, что так же оттягивает момент постановки диагноза.

После укладывания срезов на стекло (с одного блока один срез на одно стекло) препараты проходят этап рутинной окраски. В настоящее время это окраска гематоксилином и эозином на первом этапе. Затем окрашенные срезы закрываются под покровную пленку, что сохраняет их от повреждения, и подаются врачу. Происходит первичный этап диагностики – описание гистологической картины. Нередко уже на данном этапе при типичной картине можно выставить тот или иной диагноз. Обычно это касается тех случаев, когда материал не содержит опухоли, неинформативен или представлен характерным доброкачественным образованием или же стандартным патологическим процессом (например, воспалением). Однако в большинстве случаев, особенно в диагностике злокачественных процессов, требуется еще несколько этапов работы.

Таковыми являются специальные гистохимические окраски и иммуногистохимическое исследование.

В настоящее время существует множество гистохимических техник, позволяющих выявить тот или иной специфический патологический процесс. Избыточный фиброз (окраска трихромом по Массон или импрегнация серебром), отдельные болезни накопления или наличие специфических гранул в клетках (PAS), туберкулез (окраска по Циль-Нильсену) и т.д. На этом нередко заканчивается весь процесс и диагноз финализирован.

Но описанная простота диагностики лишь кажущаяся. Зачастую патоморфолог сталкивается с опухолями, не имеющими типичной гистологической картины или же не относящимися к определенной их группе. Таковыми являются мелкокруглоклеточные опухоли (лимфомы, нейробластомы, рабдомиосаркомы, нейроэндокринные карциномы и др.), веретеноклеточные опухоли (гемангиомы, шванномы, нейрофибромы, гистиоцитарные саркомы, лейомиосаркомы и т.п.), а так же различные виды аденокарцином или метастазы из невыявленного первичного очага. Прогноз у каждой из приведенных для примера опухолей различен, каждая из них имеет свой прогноз, и для каждой из них свой протокол лечения. Гистологическая картина у них может быть практически одинаковой. И для того, чтобы понять, с чем же мы имеем дело, применяется третий этап диагностики – иммуногистохимическое исследование.

Данный метод основан на использовании определенных белков (антител), которые реагируя с другими белками (антигенами) опухоли, дают определенный тип реакций (ядерная, цитоплазматическая, мембранная), видимый после окрашивания хромогеном. Практически для каждой опухоли в настоящее время существует набор характерных антител (так называемая панель), применяя которую можно подтвердить или же опровергнуть тот или иной диагноз. Существует несколько способов проведения иммуногистохимического исследования, в том числе - ручной. Однако этот метод не исключает человеческий фактор и имеет высокий риск ошибок. Это обусловлено тем, что качество и достоверность реакций непосредственно зависит от того, какое антитело и на какое стекло нанесено в то или другое время рукой человека. Следовательно, усталость, невнимательность, забывчивость имеют место быть. Поэтому от такого способа проведения иммуногистохимического исследования отказались уже давно в большинстве лабораторий. Если же вы с ним столкнулись, то вероятность ошибочно выставленного диагноза велика. Полностью автоматизированному процессу, в котором практически полностью исключен человеческий фактор, на данном этапе развития медицины отдается первое место. Применение самого современного оборудования, заведомо стандартизированных реагентов и лицензированных антител, позволяет на 100% достоверно выставить диагноз в каждом конкретном индивидуальном случае.

Применение иммуногистохимического исследования возможно не только для постановки диагноза. Данный вид исследования применяется и для определения возможности проведения таргетной (специфической) терапии, а также для определения степени злокачественности образования. Или, в случае метастазов из невыявленного первичного очага, предположить источник метастазирования.

Стоимость и срок исследования

Наименование	Срок	Стоимость, руб.
Гистологическое исследование биопсийного материала	от 3 дней	5000*
Гистологическое исследование операционного материала	от 3 дней	19500*

* Организация и оплата доставки сырого материала (не в блоках) осуществляется клиентом.

Патологоанатом рассказал, как ставится диагноз «рак»

19 января отмечается День патологоанатома. У большинства людей словосочетание «патологоанатомическое отделение» вызывает совершенно предсказуемые ассоциации: морг, труп, вскрытие. На самом деле, такая работа, по большей части, - удел судмедэкспертов. Задача врача-патологоанатома – правильная диагностика ПРИЖИЗНЕННЫХ заболеваний. В патологоанатомических отделениях больниц исследуют в основном биопсийный или операционный материал живых пациентов. На клеточном уровне.

Накануне профессионального праздника заведующий патологоанатомическим отделением Алтайского краевого онкологического диспансера Сергей Бахарев провел для «Комсомолки» эксклюзивную экскурсию и рассказал, как патологоанатомы помогают людям в борьбе против рака.

Такие разные «гисто»

- Гистология, гистохимия, иммуногистохимия (ИГХ) – часто эти три слова пациенты употребляют как синонимы, хотя, на самом деле, это совершенно разные исследования.

Первой еще в конце 19 века появилась гистология. С помощью этого метода устанавливается сам факт наличия патологии. Любой - потому что патологический процесс это же совсем не обязательно «рак». Изменения в тканях могут быть вызваны, например, воспалением. Однако в онкологии именно гистологический анализ является основанием для выставления диагноза. Все остальные лабораторные и инструментальные исследования могут лишь косвенно подтверждать его.

В основе гистохимии лежат различные способы окраски срезов тканей, в результате которых становятся видны определенные химические вещества внутри клеток и в межклеточном пространстве. Это помогает понять источник и причину патологического процесса или дать прогноз его дальнейшего развития.

Иммуногистохимия - это глубокий анализ патологического процесса со сложной реакцией антиген-антитело. На стеклопрепарат последовательно «капают» определенными реактивами (антитела): если опухолевые клетки содержат в своем составе искомые элементы (антигены), происходит химическая реакция и специфическое окрашивание содержимого пластины.

Патологоанатом изучает результат этих цветовых реакций под микроскопом и подробно описывает характеристики и особенности «поведения» опухоли: ее подтип, первичная это опухоль или ее метастаз, степень злокачественности, наличие или отсутствие молекул, чувствительных к определенным лекарственным препаратам и так далее.

Как маленький ребенок, пытаясь понять принцип работы игрушки, разбирает ее на мелкие части, так и мы с помощью иммуногистохимии на клеточном уровне видим причины и последствия злокачественной поломки в организме и с помощью чего ее можно починить.

Кстати

С помощью ИГХ Vожно «рассекретить» практически любую опухоль – главное, чтобы она уже была известна науке и классифицирована. В современных классификациях Всемирной организации здравоохранения существует несколько тысяч подвидов рака. В рутинной практике используется около 500 наименований диагнозов, встречающихся практически ежедневно.

Объясню на простом примере. Допустим, эндоскописты во время исследования взяли биопсию измененной ткани из желудка. По ее фрагменту гистология скажет, рак это или не рак, гистохимия может, например, выявить результаты жизнедеятельности бактерии Хеликобактер пилори, вызывающей патологические поражения слизистых оболочек, а ИГХ даст максимально подробный список характеристик патологии, подскажет врачам, как ее лечить с максимальным результатом.

Еще не вершина

- В эпоху гистологии классификация раковых опухолей была простой и понятной – по месту их расположения в организме: рак легкого, рак кишечника, рак молочной железы и остальные такие же раки. Однако постепенно стало очевидно, что локализация не может быть достаточным основанием для эффективного лечения. Каждый рак индивидуален, даже если у двух пациентов он возник в одном и том же месте.

Например, диагноз «рак кожи» сегодня может означать как базальноклеточную карциному, при которой человек, получив своевременное грамотное лечение, проживет до глубокой старости, так и агрессивную меланому, для которой прогноз куда менее благоприятен. И лечить эти два заболевания нужно совершенно по-разному.

А сегодня уже и иммуногистохимия, которая 20 лет назад произвела в алтайской онкологии настоящую революцию, не «потолок». Все чаще патологоанатомы работают в тесной связке с молекулярными диагностами, выявляющими опухолевые мутации. Вместе с коллегами из молекулярно-генетической лаборатории нашего диспансера (которая, кстати, единственная в крае!) мы даем врачам-клиницистам развернутый перечень маркеров опухоли, указывающих на чувствительность (или, наоборот, - нечувствительность) к таргетным и иммунным препаратам.

Иногда такие маркеры могут подсказать не только, чем лечить пациента, но и какие препараты ему назначать не следует. Например, при некоторых видах рака толстой кишки и желудка нельзя давать классическую химиотерапию в любом, даже вспомогательном, варианте.

7 раз отмерь, 107 – отрежь

- Для патологоанатомического исследования используются фрагменты тканей, взятых во время операции или биопсии. Кровь, иные биологические жидкости, соскобы и проч. нам не подходят. Первоначально нам приносят весь объем удаленных тканей, иногда это бывают гигантские опухоли по несколько килограммов – но столько нам не нужно.

Из материала делается вырезка определенных фрагментов – исходя из утвержденных критериев и собственного опыта морфолога. Например, при раке предстательной железы, размер которой примерно с пирожное «картошка», мы берем максимально около 90 сантиметровых кусочков толщиной 2 мм. Если это гигантская опухоль из брюшной полости, то таких кусочков может быть гораздо больше.

Во время исследования предстоит оценить сотни параметров жизнедеятельности опухоли – поэтому, чем больше фрагментов ткани исследуется, тем меньше шансов пропустить какой-то важный элемент, и тем точнее будет наше заключение.

Выбранные для исследования фрагменты ткани сначала фиксируются в формалине на 24 часа. Затем их закрепляют на специальную кассету, обезвоживают и пропитывают парафином в специальном оборудовании. Из первоначально мягкой ткани получается твердый кусочек, который далее нарезается микротомными лезвиями на полоски толщиной не более 0,003 – 0,004 мм. Затем эти тончайшие полоски укладываются на стекла, окрашиваются и подаются на микроскопическое исследование.

Вообще, процесс подготовки стеклопрепарата - архиважная часть патологоанатомического исследования. Минимум наполовину результат зависит от того, насколько корректно материал приготовлен. К примеру, плохо пропитанный парафином кусочек ткани ни за что не нарежется на микротоме: фрагмент испорчен, а ведь, возможно, именно он содержал в себе микроскопические элементы - подсказки об опухоли и о том, какое лечение для нее будет эффективным.

Сканер на все руки

- Год назад по федеральной программе у нас в отделении появился сканер стеклопрепаратов. Это совершенно уникальная машина, возможностям которой мы не можем нарадоваться и по сей день.

Принцип работы – как в обычном сканере для бумаги: помещаем в прибор стеклопрепараты, и он, считывая, оцифровывает то, что на них изображено. Но с одним маленьким нюансом – одновременно со сканированием изображения идет его увеличение в 400 раз. Если отсканированный лист бумаги «весит» около 2 МБ, то отсканированное изображение со стекла, которое по своему размеру в 30 раз меньше бумажного листа, будет весить уже 2 ГБ!

То есть на экране компьютера мы получаем оцифрованное изображение в том виде, как если бы смотрели на него через микроскоп. Но на компьютере-то гораздо удобнее – его можно передвигать, выделять и еще более увеличивать нужные фрагменты, автоматически, а не вручную, вести подсчет клеточных элементов, имеющих значение для анализа.

Однако возможность иметь такой сканер не ограничивается одним только удобством. С появлением этого прибора мы впервые начали формировать собственный электронный архив сложных и редких случаев, необходимых для корректной диагностики аналогичных диагнозов в будущем. Вернуться к ним теперь всегда можно всего в пару кликов!

Кроме того, имея цифровое изображение, идентичное тому, что патолог субъективно видит под микроскопом, мы можем получать по нему второе экспертное мнение, отправляя на телеконсультацию в федеральные медицинские центры. И этой возможностью мы тоже активно и успешно пользуемся.

До чего дойдет прогресс

- Вообще, перспектива перехода всех патологоанатомических отделений на цифровой анализ биоматериала, очень заманчива. Как ни крути, сейчас диагноз сильно зависит от субъективной оценки специалиста, его знаний, опыта, профессиональной интуиции. И хотя в специалистах нашего отделения я уверен, все же цифровая обработка стеклопрепаратов в рутинной практике привела бы к бОльшей объективизации онкологических диагнозов.

Я даже не сомневаюсь, что это всего лишь вопрос времени. До 2000-х годов прошлого века патологоанатомы Алтайского края вообще не знали, что такое ИГХ. Если пофантазировать и представить, что методики иммуногистохимии вдруг исчезли из нашей практики, онкодиспансер начал бы работать как обычный ФАП (фельдшерско-акушерский пункт). Самые современные лекарства, требующие четких и конкретных показаний для применения, назначались бы вслепую.

Сейчас, зная особенности каждой конкретной опухоли, врач может определить, какие комбинации препаратов будут наиболее эффективны для каждого больного. Благодаря этим знаниям, онкологам уже удалось покорить некоторые «крепости», которые считались неприступными.

На заметку

По закону, стеклопрепараты (грубо говоря, это частицы удаленной опухоли пациента, залитые в парафин), или как их еще называют «стеклышки», хранятся в медицинском учреждении 25 лет. Это нужно для того, чтобы всегда иметь возможность пересмотреть анализ, утонить недостающие или сомнительные данные. Каждое стекло под микроскоп патологоанатома попадает минимум 1 раз – на обязательную гистологию. Реже – трижды: на гистологию, гистохимию и ИГХ. Чаще всего патологи проводят для одного стеклопрепарата гистологию и ИГХ. Последний метод с каждым годом все более совершенствуется, постепенно заменяя и вытесняя гистохимический анализ.

Принципы классификации по гистологическим типам рака легкого

Гистологическая классификация рака легкого имеет важно значение в корректном определении прогноза и подборе терапии. Новая классификация, предложенная Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) в 2015 году, позволила сделать гистологическое типирование опухолей максимально информативным.

Особенности классификации опухолей легкого ВОЗ 2015 года

Классификация ВОЗ 2015 года отличается от предыдущих: основным ее преимуществом является упор на иммуногистохимическую диагностику опухолей [1]. К тому же новая классификация применима не только к операционным, но и к небольшим образцам, получаемым при биопсии, и цитологическому материалу, что играет существенную роль в успешной диагностике, поскольку у большинства пациентов рак легкого диагностируется на поздней стадии заболевания, когда хирургическое лечение уже нецелесообразно [1].

Кроме того, классификация 2015 содержит рекомендации для проведения молекулярного тестирования многих подтипов опухолей, в том числе и самого распространенного в настоящий момент – аденокарциномы, что дает возможность четко определиться с генетическими изменениями и подобрать соответствующую таргетную терапию.

Изменения, введенные в классификацию ВОЗ 2015 по сравнению с предыдущей классификацией 2004 года, обусловлены несколькими факторами, изученными за эти годы и в определенной мере изменившими взгляд на диагностику и терапию рака легкого.

Прежде всего, за это время были сделаны важные открытия в понимании специфических молекулярных путей, приводящих к развитию рака легкого. Эти знания обосновывают необходимость проведения молекулярного типирования опухолей, на основании которого используются таргетные препараты с высоким уровнем противоопухолевой активности (для пациентов с подтвержденными «драйвер-мутациями»). Примером подобной тактики являются ингибиторы тирозинкиназы рецептора эпидермального фактора роста (ИТК EGFR), которые стали основой терапии для пациентов с метастатической аденокарциномой легкого при наличии мутации EGFR. Таргетная терапия также является предпочтительным подходом терапии аденокарциномы легкого при транслокации EML4-ALK.

Кроме того, за период с 2004 по 2015 год были опубликованы результаты исследований, которые позволили эффективно дифференцировать плоскоклеточную карциному от других гистологических типов немелкоклеточного рака легкого, в том числе и аденокарциномы, на небольших биопсийных образцах 4. Это особенно важно, поскольку некоторые препараты противопоказаны пациентам с плоскоклеточным раком вследствие недостаточной эффективности (к примеру, пеметрексед) или потенциальной токсичности (бевацизумаб).

Аденокарцинома легкого

Аденокарцинома – наиболее распространенный тип рака легкого на сегодня. Предположительно рост заболеваемости связан с популярностью сигарет с низким содержанием смолы и сигарет с фильтром, при курении которых человек делает более глубокий вдох, и, как следствие, табачный дым оседает в периферических дыхательных путях, где чаще всего и развивается аденокарцинома [5].

В новой классификации ВОЗ выделяется два подтипа аденокарциномы, которые отсутствовали в предыдущих версиях:

Аденокацинома in situ
Минимально инвазивная аденокарцинома

Первый подтип, аденокарцинома in situ (AIS), представляет собой локализованную (≤3 см) аденокарциному, рост которой ограничен поверхностным ростом вдоль альвеолярных структур (со стелющимся типом роста, «lepidic»), без признаков инвазии. В большинстве случаев AIS – немуцинозные опухоли. Проспективные исследования свидетельствуют, что при полной резекции AIS выживаемость приближается к 100% (97%) [6].

Минимально инвазивная аденокарцинома (МИА) – также небольшая одиночная опухоль размером ≤3 см, однако, в отличие от AIS, со стелющимся типом роста и минимальной инвазией, не превышающей 5 мм. Большинство опухолей не вырабатывают муцин. Безрецидивная выживаемость в течение 5 лет у пациентов, по данным наблюдений, также должна достигать 97% при условии полной хирургической резекции [6].

Необходимо добавить, что для установления гистологического диагноза AIS и МИА желателен операционный, а не биопсийный образец опухоли [1].

Термин «стелющийся тип роста» («lepidic») был предложен в 2011 году в Журнале торакальной онкологии [7]. Он пришел на смену устаревшему термину «бронхоальвеолярный», поскольку последний мог применяться в различных подтекстах и не давал точной характеристики. Опухоли, которые раньше классифицировались как бронхоальвеолярные, теперь причисляются к одной из нескольких категорий: AIS, минимально инвазивная аденокарцинома или атипическая аденоматозная гиперплазия. Последняя рассматривается как преинвазивное поражение аденокарциномы легких, не превышающее 5 мм.

Так же, как и в публикации Журнала торакальной онкологии 2011 года, классификация ВОЗ 2015 года предлагает дифференцировать пять типов аденокарциномы легкого:

Со стелющимся ростом
Ацинарная
Папиллярная
Микропапиллярная
Солидная

Инвазивные аденокарциномы классифицируются по преобладающей картине роста. При этом важно упомянуть процент компонента со стелющимся ростом, а также перечислить другие подтипы опухолевой ткани и их процентное соотношение. ВОЗ рекомендует оценивать последнее на основании 5-процентных интервалов. В новой классификации они подразделяются на четыре подтипа:

Инвазивная муцинозная аденокарцинома
Коллоидная аденокарцинома
Фетальная аденокарцинома
Аденокарцинома кишечного типа

Аденосквамозная карцинома

Аденосквамозная карцинома определяется как опухоль, состоящая более чем на 10% из злокачественных железистых и плоскоклеточных компонентов. По всей вероятности, смешанная гистология отражает гетерогенность карциномы легкого [8].

Чтобы определить гистологическую принадлежность, как правило, требуется операционный образец опухоли, поскольку для установления подобного диагноза необходимо не менее 10% каждого компонента в образце [1]. Если в малых биопсийных образцах удается гистологически и/или иммуногистохимически выделить компоненты аденокарциномы и плоскоклеточного рака, предлагается использовать термин «возможная аденосквамозная карцинома».

Частота встречаемости аденосквамозной карциномы находится в диапазоне от 0,4% до 4% всех случаев бронхогенного рака. Этот подтип опухоли более агрессивен, чем аденокарцинома или плоскоклеточная карцинома, и, соответственно, сопряжен с худшим прогнозом [9]. Поскольку в составе аденосквамозной карциномы содержатся железистые элементы, целесообразно проводить ее молекулярное тестирование с целью выявления «драйвер-мутаций» и определения возможностей использования таргетной терапии.

Плоскоклеточный рак

Плосколеточный рак был наиболее частым гистологическим типом среди опухолей легкого до середины 80-х годов прошлого века. В последние десятилетия он уступил «лидерство» аденокарциноме.

Для плоскоклеточного рака характерно образование опухолевыми клетками и/или межклеточными десмосмами кератина. В классификации ВОЗ 2004 года плоскоклеточный рак подразделялся на папиллярный, светлоклеточный, мелкоклеточный и базалоидный типы опухолей [10]. В новой классификации 2015 число подтипов плоскоклеточного рака сокращено до трех, что упрощает диагностику за счет исключения крайне редких гистологических подтипов опухоли:

Ороговевающий рак
Неороговевающий рак
Базалоидный плоскоклеточный рак

Изменения, характерные для светлоклеточной карциномы, согласно новой классификации, рассматриваются как цитологическая особенность, но не как отдельный подтип рака легкого [1].

Опухоль считается неороговевающей при отсутствии гистологических признаков ороговевания, ороговевающей в случае наличия ороговевания и базалоидной, если базалоидные изменения составляют более 50% опухоли. При неороговевающих опухолях целесообразно проведение иммуногистохимического исследования с целью дифференциации плоскоклеточной опухоли, солидной аденокарциномы и крупноклеточной карциномы с нулевым фенотипом.

От 60% до 80% плоскоклеточных опухолей развиваются в проксимальных участках трахеобронхиального дерева, хотя они могут представлять собой и периферические образования [11]. Для центрального и периферического плоскоклеточного рака может быть характерен обширный центральный некроз с образованием полостей. Небольшая часть центральных, хорошо дифференцированных плоскоклеточных опухолей легкого может представлять собой экзофитные, эндобронхиальные и папиллярные образования. Симптоматически такие типы опухоли проявляются постоянным кашлем, рецидивирующим кровохарканьем и развитием инфекционного процесса в легких вследствие обструкции дыхательных путей.

У пациентов с экзофитной эндобронхиальной плоскоклеточной опухолью легкого заболевание может выявляться на ранней стадии и протекать с благоприятным прогнозом. Пятилетняя выживаемость в подобных случаях превышает 60% [12].

Крупноклеточная карцинома

Крупноклеточная карцинома, представляющая собой лишенное железистой и плоскоклеточной дифференциации, а также цитологических особенностей, присущих мелкоклеточной карциноме, образование, диагностируется при отсутствии гистологических признаков других подтипов опухоли, представляя собой по сути диагноз исключения. Для установки диагноза нейроэндокринной карциномы необходимо подтвердить наличие хотя бы одного иммуногистохимического маркера нейроэндокринного рака.

Поскольку диагноз крупноклеточной карциномы устанавливается после исключения других подтипов карцином, довольно сложно ставить его по результатам гистологического исследования малых эндоскопических биопсийных или цитологических образцов [10].

Нейроэндокринные опухоли

В предыдущих изданиях классификации ВОЗ различные нейроэндокринные опухоли, в частности, мелкоклеточная карцинома и карциноиды, были отнесены к различным типам, в то время как крупноклеточная нейроэндокринная карцинома причислялась к крупноклеточным карциномам. В новой классификации 2015 года впервые все нейроэндокринные опухоли объединены в один гистологический тип. К нему отнесены:

Мелкоклеточная карцинома
Крупноклеточная нейроэндокринная карцинома
Типичный карциноид
Нетипичный карциноид

К этой категории также отнесена диффузная идиопатическая легочная нейроэндокринно-клеточная гиперплазия, а также преинвазивное эпителиальное поражение [13].

В группе легочных нейроэндокринных опухолей типичные и атипичные карциноиды имеют ряд особенностей, объединяющих их с карциноидными поражениями другой локализации. Мелкоклеточные карциномы и крупноклеточные нейроэндокринные карциномы клинически характеризуются более агрессивным течением и более высокой скоростью митоза по сравнению с легочными карциноидами [10].

Принципы дифференциальной диагностики на основании иммуногистохимического окрашивания

Диагноз первичного рака легких носит клинико-патологический характер. Опухоль легкого морфологически может быть схожа со многими другими метастатическими поражениями, поэтому при обнаружении злокачественного новообразования легкого особую важность приобретает иммуногистохимический анализ, позволяющий дифференцировать опухоли различной локализации и установить правильный диагноз. В этом разрезе может быть полезным иммуногистохимическое и гистохимическое окрашивание.

Таблица 1. Дифференциальная диагностика неоплазм с помощью иммуногистохимического и гистохимического окрашивания [14, 15].

Исследование клеток ткани, которое проводится с помощью специальных реактивов.

Синонимы русские

ИГХ, иммуногистохимия, иммуногистохимический анализ.

Синонимы английские

Immunohistochemistry, IHС, immunohistochemical analysis.

Метод исследования

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Образец ткани / образец ткани в парафиновом блоке.

Как правильно подготовиться к исследованию?

Общая информация об исследовании

Иммуногистохимическое исследование клинического материала проводится в целях выявления в нем искомых веществ. Готовые гистологические препараты обрабатываются специальными реактивами, содержащими меченые специфические антитела к выявляемому веществу, которое в данной ситуации служит антигеном. Если искомое вещество находится в исследуемом материале, то антитело связывается с его определенными участками. В результате этого между ними образуется комплекс и происходит окрашивание ткани.

Данный метод используется в диагностике различных патологических состояний, особенно велика его роль в области онкологии. Иммуногистохимическое (ИГХ) исследование помогает не только диагностировать опухоль, определить ее нозологический вариант, выявить первичный опухолевый очаг и обнаружить раковое перерождение клеток, но также спрогнозировать варианты течения заболевания и успешность лечения. К факторам, влияющим на прогноз, относятся рецепторы к эстрогенам и к прогестерону, Ki-67 (маркер активности опухоли), her-2 neu (эпидермальный фактор роста, определяет чувствительность опухоли к химиопрепарату трастузумабу/герцептину), VEGF (сосудистый фактор роста), Bcl-2, р53 и др. В отличие от иммуногистохимического анализа, их невозможно определить при обычном гистологическом исследовании.

Также этот метод нашел применение в диагностике системных заболеваний соединительной ткани и болезней почек, позволяет выявлять бактерии и вирусы в изучаемых тканях, например вирус Эпштейна - Барр, папиллома-вирус, Helicobacter Pylori (у больных хроническим гастритом), микобактерии при диагностике туберкулеза и др.

На основе ИГХ-анализа врач получает заключение с положительными и отрицательными маркерами, и это помогает подтвердить или опровергнуть гипотезу других клинико-лабораторных исследований.

Рак шейки матки относится к наиболее распространенным видам рака у женщин. Эпидемиологические и лабораторные данные подтверждают роль человеческого папиллома-вируса (ВПЧ, HPV) в качестве запускающего агента для подавляющего большинства предраковых и злокачественных поражений эпителия слизистой оболочки шейки матки. При этом ДНК ВПЧ могут быть обнаружены в 95-100% всех случаев.

Вирус папилломы человека представляет собой небольшие циркулярные двухцепочечные вирусы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), принадлежащие к семейству Papillomaviridae. Известно более 130 типов ВПЧ. Они классифицируются по степени риска, основанного на их связи с цервикальной карциномой. ВПЧ 16 и 18 являются наиболее часто встречающимися типами высокого риска. Внедряясь в эпителиальные клетки, вирус вызывает в них дефекты генов, тем самым способствуя развитию опухоли. При помощи ИХГ легко обнаружить в клетках, пораженных HPV, экспрессию белков p16 и p18, и их позитивность сильно коррелирует с позитивностью HPV. Это помогает различить неопухолевую дисплазию (как результат воспаления) и опухолевую (вызванную вирусом папилломы и способную переродиться в рак), а также позволяет провести дифференциальную диагностику дисплазии умеренной и высокой степени тяжести (CIN II/III) и начальных форм рака шейки матки, выявление поражений, склонных к прогрессированию и развитию инвазивной карциномы. В дисплазиях умеренной и высокой степени (в 80-100% случаев CIN II и практически во всех случаях CIN III) и инвазивном раке шейки матки определяется усиленная экспрессия белка p16, и она усиливается по мере нарастания тяжести поражения.

У женщин с плоскоклеточными интраэпителиальными поражениями низкой степени тяжести очаговая и диффузная экспрессия свидетельствует о прогрессировании заболевания. Отсутствие или очаговая экспрессия p16 в поражениях высокой степени может служить дополнительным признаком благоприятного течения патологического процесса.

Применяется иммуногистохимическое исследование и при дифференциальной диагностике целиакии.

Целиакия – это системное заболевание, обусловленное генетической непереносимостью глютена или соответствующих проламинов, которые содержатся в семенах злаков. Характеризуется данная патология повреждением слизистой оболочки тонкой кишки (развитием атрофической энтеропатии), появлением в сыворотке крови специфических антител и широким спектром глютензависимых клинических проявлений. Заболевание встречается в два раза чаще среди женщин, чем среди мужчин, может впервые проявиться как в детстве, так и у взрослых. Целиакия может протекать с ярко выраженной или со стертой клинической картиной, а также без гастроэнтерологической симптоматики. Чаще всего встречается стертый вариант течения заболевания, поэтому диагностика глютеновой энтеропатии (ГЭ) затруднена.
На первичном лабораторном этапе проводится серологическое исследование, определяющее в крови специфические биомаркеры. Лицам с положительными результатами показана эндоскопия тонкой кишки с биопсией и последующим гистологическим и ИГХ анализом взятого материала.

Известно, что целиакия сопровождается повышением числа лимфоцитов внутри эпителиальных клеток тонкой кишки. При этом отличительной особенностью является то, что большинство интраэпитиальных лимфоцитов (ИЭЛ) несут на своей поверхности специфический Т-клеточный рецептор (CD3 γ и CD3δ-положительные клетки). Чем активнее протекает заболевание, тем больше ИЭЛ. Эта особенность используется при проведении иммуногистохимического исследования, позволяющего определить преобладающий тип лимфоцитов. Особенно важен этот анализ, когда существует расхождение между данными серологического исследования и гистологической оценкой на стандартных участках.

Для чего используется исследование?

Для определения вида и подвида опухоли, степени ее злокачественности и распространенности онкологического процесса;
для дифференциальной диагностики пролиферативных заболеваний;
для определения этиологического фактора, вызвавшего изменения в клетках;
для подбора эффективной терапии;
для оценки пролиферативной активности клеток опухоли;
для оценки эффективности лечения;
для диагностики рецепторного статуса при онкологическом заболевании (например, раке молочной железы, предстательной железы);
для определения первичного очага опухоли;
для выявления злокачественного потенциала пораженных клеток;
для первичного отбора пациентов для диспансерного учета и дальнейшего обследования;

Когда назначается исследование?

При дифференциальной диагностике дисплазии (высокой и умеренной степени) и начальной стадии рака шейки матки;
при раке молочной железы, желудка, предстательной железы в целях определения чувствительности к различным видам терапии;
при определении степени злокачественности и оценки прогноза заболевания;
при оценке эффективности терапии;
при поиске источника метастазов;
при диагностике гастроинтестинальных стромальных опухолей (GIST) с помощью расширенной панели антител, включающей DOG1;
при диагностике нейроэндокринных опухолей;
при дифференциальной диагностике целиакии, сопровождающейся неясной гистологической картиной;
при расхождении результатов серологического исследования и гистологической оценки.

Что означают результаты?

Диапазон значений индивидуален для каждого заболевания, зависит от используемых антител.

Расшифровка результатов исследования содержит информацию для лечащего врача и не является диагнозом.

Проводится морфологическая оценка препарата (опухоли классифицируются согласно ВОЗ), дается описательный ответ с указанием оценки экспрессии антитела. ИХГ всегда следует использовать в качестве дополнения к морфологическому исследованию, результаты не следует интерпретировать изолированно.

Что может влиять на результат?

При некоторых заболеваниях есть факторы, которые могут влиять на результат. Так, при диагностике целиакии назначение безглютеновой диеты до исследования может приводить к получению ложноотрицательного результата.

Читайте также: